第二节 实验动物的一般操作技术

一、目的和意义

毒理学研究需要用实验动物来进行各种实验，通过对动物的实验观察和分析来研究毒作用，获得毒物的毒性、剂量-反应关系、毒作用机制等方面的资料，因此动物实验是毒理学研究中重要的手段之一。

通过本次实习学习毒理学实验中有关动物实验的基本操作技术，掌握实验动物的选择、动物抓取、染毒方法和生物材料的采集等技术。

二、内容

（一）健康动物的选择

无论选择哪种种属品系的动物进行实验，均要求选择健康的实验动物。健康动物检查时要求达到：外观体形丰满，被毛浓密有光泽、紧贴体表，眼睛明亮，行动迅速，反应灵活，食欲及营养状况良好。选择时重点检查以下项目：

（1）眼睛明亮，瞳孔双侧等圆，无分泌物。

（2）耳道无分泌物溢出，耳壳无脓疮。

（3）鼻无喷嚏，无浆性粘液分泌物。

（4）皮肤无创伤、无脓疮、疥癣、湿疹。

（5）颈部要求颈项端正，如有歪斜提示可能存在内耳疾患，不应选作实验动物。

（6）消化道无呕吐、腹泻，粪便成形，肛门附近被毛洁净。

（7）神经系统无震颤、麻痹。若动物（大鼠、小鼠）出现圆圈动作或提尾倒置呈圆圈摆动，应放弃该动物。

（8）四肢及尾四肢、趾及尾无红肿及溃疡。

（二）实验动物的性别鉴定

动物性别不同对毒物的敏感性也不同，这可能与性激素、肝微粒体羟基化反应有关，也随受试物而异。因此，要根据实验要求选择性别，一般实验如对性别无特殊要求者，宜选用雌雄动物各半。

（1）大鼠、小鼠主要依肛门与生殖器孔间的距离加以区分。间距大者为雄性，小者为雌性。雌性生殖器与肛门之间有一无毛小沟，距离较近。雄性可见明显的阴囊，生殖器突起较雌鼠大，肛门和生殖器之间长毛。另外成年雄性卧位可见到睾丸，雌性在腹部可见乳头（图1-2）。

（2）豚鼠 用一只手抓住豚鼠颈部，另一只手扒开靠生殖器孔的皮肤，雄性动物在圆孔中露出性器官的突起，雌性动物则显出三角形间隙，成年雌性豚鼠胸部有两个乳头。

（3）家兔 将家兔头轻轻夹在实验者左腋窝下，左手按住腰背部，右手拉开尾巴并将尾巴夹在中指和无名指中间，然后用拇指和食指稍稍把生殖器附近的皮肤扒开。雄兔即可见到一圆孔中露出圆锥形稍向下弯曲的阴茎（但幼年雄兔看不到明显的阴茎，只能看到圆孔中有凸起物，即是阴茎）。雌兔此处则为一条朝向尾巴的长缝，呈椭圆形的间隙，间隙越向下越窄，此即为阴道开口处（图1-3）。

（三）实验动物的抓取方法

正确地抓取固定动物，是为了在不损害动物健康、不影响观察指标、并防止被动物咬伤的前提下，确保实验顺利进行。

（1）小鼠的抓取方法：首先用右手从笼盒内抓取鼠尾提起，注意不可抓尾尖（图1-4A），放在鼠笼盖或实验台上向后拉（图1-4B），在其向前爬行时，迅速用左手拇指和食指抓住小鼠的两耳和颈部皮肤（图1-4C），将鼠体置于左手心中，把后肢拉直，以无名指按住鼠尾，小指按住后腿即可（图1-4D）。

（2）大鼠的抓取方法：大鼠的抓取基本同小鼠，只是大鼠比小鼠性情凶猛，不易用袭击方法抓取。为避免咬伤，可带上帆布或棉纱手套。采用左手固定法，用拇指和示指捏住鼠耳，余下三指紧捏鼠背皮肤，置于左掌心中，这样右手可进行各种实验操作（图1-5）。

（3）豚鼠的抓取方法：豚鼠胆小易惊，在抓取时要稳、准、迅速。用手掌迅速扣住鼠背，抓住其肩胛上方，以拇指和示指环握颈部（图1-6A），另一只手托住臀部即可（图1-6B）。

（4）兔的抓取方法：用右手抓住兔颈部的毛皮提起，然后左手托住其臀部或腹部，让其体重的大部分重量集中在左手上。注意不要抓取双耳或抓提腹部（图1-7）。

（四）实验动物称重、编号、标记方法

1．称重大、小鼠秤的感应量需在0.1g以下

根据实验的不同要求，选择一定数量的大、小鼠，体重要求在同一组内、同性别动物体重差异应小于平均体重的10%，不同组间同性别动物体重均值差异应小于5%。

2．编号

动物编号方法有多种。大、小鼠常用方法如下：

（1）染色法：染色法是用化学剂在动物身体明显部位如皮毛、四肢等处进行涂染，或用不同颜色等来区别各组动物，是实验室最常用、最容易掌握的方法。

常用的标记液有苦味酸酒精饱和溶液（黄色）。标记时，用标记笔取上述溶液，在动物体表不同部位涂上斑点，以示不同号码。一般把涂在右前肢上的记为1号，按顺时针方向，依次右后肢为2号，左后肢为3号，左前肢为4号，头部为5号（图1-8A）,6～10则由以上5个基本数复合而成，比如6号则是在头部和右前肢标记各一（图1-8B）,7号为在头部和右后肢体标记一，以此类推。在动物的背部划一长条为10号。10号以上均由上述复合方法进行编号。例如：16号是在头部、右前肢、背部均有标记（图1-8C）。

（2）剪耳法：在耳朵不同部位剪一小孔代表某个号码。常以右耳代表个位，左耳代表十位。或与染色法配合使用，右耳剪孔代表十位。

（3）烙印法：是用刺数钳在动物耳上刺上号码，然后用棉签蘸着溶在酒精中的黑墨在刺号上加以涂抹，烙印前最好对烙印部位预先用酒精消毒。

（4）号牌法：用金属的牌号固定于实验动物的耳上，大动物可系于颈上。

（五）实验动物的分组方法

为了得到客观的剂量-反应关系，应将一群动物按统计学原则随机分配到各个实验组中。可按随数字表方法进行随机分组（见随机数字表方法分组说明）。但小动物的年龄和体重呈正相关，而年龄又与毒物代谢动力学密切相关。为了减少实验各组动物间的体重差异，在实际工作中常采用体重均衡法（简化分层随机法）进行分组，即将同一性别的动物按体重大小顺序排列，分组时由体重小的到大的，依次随机分配到各组。一种性别的动物分完以后，再分配另一种性别的动物。各组雌雄性动物的数目应尽可能相等。

体重均衡法分配方法如下：

第一步 将动物按体重分组

以急性毒性实验时使用小鼠为例，一般按照18g～,19g～,20g～,21g～,22g～, 23g～,24g～分为7组，所有动物称重后放入相应的体重组中。

第二步 将同一体重段的动物均匀分配至各实验组中

从最低体重组中随意取出一只动物放入实验组第一组，第二只动物放入第二组，以此类推，直到该组动物用完。再从下一体重组中随意取出动物，依次放入各实验组直至实验各组均得到一只动物。如此反复循环操作，将所有动物分完为止，结果会使体重相近的动物被均匀分布到各实验组中。

随机数字表方法分组说明如下。

例如：设将30只雄性动物平均分成A、B、C、D、E、F六组，每组5只动物。将巳编号的动物以号码按随机数字表进行分配。如选随机数字表第二行，从第一个数字开始，顺次抄下30个数字（可依横行、竖行或斜行抄录）。将每个数字一律除以6（组数），根据余数1、2、3、4、5、0（整除者）分别将动物分配到A、B、C、D、E、F组，结果见表1-6（数字源见随机数字表第二行）。

按上法分组后，A组有动物7只，B组7只，C组6只，D组与E组各2只，F组6只。为了使每组动物数均为5只，需要根据随机分配的原则再选出2只A组和1只C组动物给D组。B组选出2只，F组选出1只给E组。具体方法如下：继续抄下随机数字分别除以A、B、C、F组的动物数，既56/7（7为A组动物数）整除，余数为0，将A组第7只动物（25号）调配给D组；下一个：50/6（6为A组动物数）余2，将A组第2只动物（4号）调配给D组；接下来26/6（6为C组动物数）余2，将C组第2只动物（9号）给D组。余类推，最后调整分组成表1-7所示。雌性动物也按上法分组，然后将雌、雄动物合组进行实验。

（六）实验动物被毛去除方法方法有三种：剪毛、拔毛和脱毛。

（1）剪毛：固定动物后，用粗剪刀剪去所需部位的被毛。应注意以下几点：①把剪刀贴紧皮肤剪，不可用手提起被毛，以免剪破皮肤。②依次剪毛，不要乱剪。③剪下来的被毛集中在一个容器内，勿遗留在手术野和操作台周围。

（2）拔毛：多用于兔耳缘静脉注射或取血时，以及给大、小鼠作尾静脉注射时，需用拇指、示指将局部被毛拔去，以利操作。

（3）脱毛：脱毛系指用化学药品脱去动物的被毛，适用于无菌手术野的准备以及观察动物局部皮肤血液循环和病理变化。常用硫化钡或依据脱毛剂配方配制脱毛剂。

（七）实验动物染毒途径和方法

毒理学实验中染毒途径的选择，应尽可能模拟人在接触该受试物的方式。最常用的染毒途径为经口、经呼吸道、经皮及注射途径。不同途径的吸收速率，一般是：静脉注射＞吸入＞肌肉注射＞腹腔注射＞皮下注射＞经口＞皮内注射＞其他途径（如经皮等）。毒理学则主要采用经口（胃肠道）染毒常用有灌胃、喂饲和吞咽胶囊等方式。

（1）灌胃：将受试物配制成溶液或混悬液，以注射器经导管注入胃内。一般灌胃深度从口至剑突下，最好是利用等容量灌胃法，即受试物配制成不同浓度，实验动物单位体重的灌胃容量相同。大鼠隔夜禁食，小鼠可禁食4小时（因小鼠消化吸收和代谢速度较快），均不停饮水。灌胃后2～4小时提供饲料。经口多次染毒，一般不禁食，但应每日定时染毒。灌胃法优点是剂量准确，缺点是工作量大，并有伤及食道或误入气管的可能。

灌胃针与灌胃方法：见图1-10、图1-11、图1-12。

（2）吞咽胶囊：将一定剂量的受试物装入胶囊中，放至狗的舌后部，迫使动物咽下，此法剂量准确，适用于易挥发、易水解和有异味的受试物。

（3）喂饲：将受试物掺入动物饲料或饮水中供实验动物自行摄入。饲料中掺入受试物不应超过5%，以免造成饲料营养成分改变而影响实验动物的生长发育。喂饲法符合人类接触受试物的实际情况，但缺点多，如适口性差的受试物，实验动物拒食；易挥发或易水解的受试物不适用。而且，实验动物应单笼喂饲，以食物消耗量计算其实际染毒剂量。

（八）实验动物生物材料采集和制备

1．动物常用采血方法

（1）大、小鼠鼠尾采血方法：适用于需血量少的实验。方法：将动物固定后，把鼠尾浸入45～50℃温水中使尾静脉充血，擦干皮肤后，再用酒精棉球擦拭消毒。剪去尾尖（0.2～0.3cm），拭去第一滴血，用血色素吸管（根据需要事先在吸管内加入与不加抗凝剂）吸取一定量尾血，然后用于棉球压迫止血。也可以不剪尾，以lml注射器连上7～8号针头直接刺破尾静脉进行定量采血。

（2）眼眶静脉丛采血法：操作者以左手拇指、示指紧紧握住大鼠或小鼠颈部压迫颈部两侧使眶后静脉丛充血（注意用力要恰当，以防止动物窒息死亡），右手持玻璃毛细管从一侧眼内眦部以45刺入，捻转前进。如无阻力继续刺人，有阻力就抽出玻璃°毛细管调整方向后再刺入，直至出血为止。右手持容器收集血液后，拔出毛细管，用干棉球压迫止血。见图1-13。

（3）腹主动脉或股动（静）脉采血法：为一次性采血方法。大、小鼠麻醉后，仰卧位固定动物，剪开腹腔，剥离暴露腹主动脉或暴露股动（静）脉，用注射器刺入采血。

（4）断头采血法：该法可用于大、小鼠。操作者左手握住动物，右手持剪刀，快速剪断头颈部，倒立动物将血液滴入容器。注意防止剪断的毛发掉入接血容器中。也可用大鼠断头器断头后，倒立动物接血。

（5）家兔耳缘静脉采血法：家兔在兔盒中固定，拔掉一侧耳缘部细毛，轻轻以手指弹耳，使耳缘静脉充血，酒精消毒。左手压迫耳根，右手持针刺破静脉收集血液；或直接用注射器进针，耳缘静脉采血。

（6）心脏采血法：将兔或大、小鼠以仰卧位固定，家兔需在左侧胸3～4肋部位剪毛，常规消毒。于第3～4肋间近胸骨左缘处，手触心搏最强部位进针，采血。采血毕迅速拔针，用酒精棉球压迫止血。大、小鼠则在手触心搏最明显处进针。

实验动物每次（日）采血量不可过多，最大安全采血量见表1-8。

2．动物尿液的收集

收集大小不同动物的尿液，一般使用不同类型的代谢笼。代谢笼主要由备有动物饮水和装饲料的笼体、粪尿分离器和收集尿液容器组成。一般笼体为金属与铁丝制成，如实验要求防止金属污染时，则代谢笼应用玻璃或有机玻璃制作。

兔、狗等大动物也可用导尿法收集尿液。

为了使收集的实验动物尿液满足实验需要，可在收尿前给动物一定量的水，如大鼠可先行灌胃1～5ml水或腹腔注射生理盐水。

（九）实验动物的处死方法

（1）颈椎脱臼法：左手按住鼠头，右手抓住鼠尾猛力向后拉，使动物颈椎拉断脱节而立即死亡。此法多用于处死小鼠。

（2）断头法：操作者用右手按住大鼠或小鼠头部，左手握住背部，露出颈部，助手用大剪刀或断头器剪断颈部使之死亡。也可使用断头器。

（3）击打法：右手抓住鼠尾，提起，用力摔打其头部，鼠痉挛后立即死亡。也可用小木锤或器具猛力击打动物头部，使其立即死亡，常用于处死家兔或大鼠。

（4）麻醉致死法：在密闭容器中预先放入麻醉剂（氯仿或乙醚），然后将动物放入，密封盖好，使动物吸入过量麻醉剂致死。

（5）麻醉后急性放血法：该法多用于处死大鼠。先腹腔注射麻醉动物后，固定动物于仰卧位，左手持镊子提起大腿内侧皮肤，右手用剪刀作一切口并向腹股沟方向剪开皮肤，皮肤切口长3～4cm。用镊子分离筋膜，于腹股沟中点大腿内侧深部，暴露股动脉和静脉，用剪子剪断股动脉即有大量血液流出，动物迅速死亡。

（6）空气栓塞法：用注射器向动物静脉内迅速注入一定量的空气，使之形成气栓栓塞血管，引起循环障碍致死。该法适用于大动物，如兔、狗、猴等。使用时注意需注入足够量的空气。

（7）化学药物致死法：此法适用于较大动物如兔或狗等。方法是给动物静脉注射化学药物而致死。常用10%KCI或10%甲醛溶液进行静脉注射。

（8）开放性气胸法：将动物开胸，造成开放性气胸，此时胸膜腔的压力与大气压力相等，肺脏因受大气压缩发生萎缩、纵隔摆动使动物窒息而死。