第一篇　正常肾脏结构与功能

第一章　肾脏发育生物学

肾脏发育生物学是一门研究胚胎期肾脏发育过程的生物学科。肾脏是由多种同步发育的细胞系共同构建而成，细胞系间复杂的相互作用使肾脏发育成为研究基因和蛋白表达时空顺序、功能状态和调控过程的良好模型。肾脏发育的研究历程也是生物研究方法学的发展史。一个世纪以前，我们对肾发育的细胞生物学还知之甚少。随着光镜、电镜的出现，肾脏发育的过程逐渐明晰，原位杂交、免疫组织化学以及基因芯片技术进一步揭示了肾脏发育的分子解剖学机制。近年来，转基因动物的出现使针对肾脏发育过程中的基因表达与调控研究更加深入，并提供了大量研究先天性肾脏疾病的实验动物模型。研究肾脏的正常发育过程有助于更好地理解先天性肾脏形态或功能异常的发生机制，为先天性肾脏和尿路发育畸形的治疗提供基础。

本章节主要描述肾脏发育的基本过程，并简要阐述其中已知的分子及细胞生物学机制，同时对常见的肾脏发育异常相关疾病进行概述，最后对肾脏发育方面生物工程的进展做出总结。需要注意的是，文中提到的研究进展大部分来源于模式动物或体外细胞实验，应审慎对待实验结果与人类肾脏发育的相关性。

第一节　肾脏胚胎发育的过程

一般而言，哺乳动物（包括人类）胚胎期的肾脏发育分为三个阶段，即前肾（pronephros）、中肾（mesonephros）及后肾（metanephros）。前肾和中肾在出生前均退化、消失，后肾最终发育为成年永久肾脏，亦称作恒肾（permanent kidney）。

一、前肾和中肾

前肾的发生始于妊娠第22天（人类）、8天（小鼠）或10天（大鼠）。人类胚胎发育的过程中，随着胚胎侧面体褶的形成，位于颈部体节的间叶中胚层（intermediate mesoderm）细胞逐渐向腹侧移动，形成左右两条纵行的条索状结构，称为生肾索（nephrogenic cord）。生肾索头端部分细胞受诱导分化，形成数条横行小管状结构，称为前肾小管（pronephric tubule）。前肾小管的外侧端部分向尾部延伸，并相互连接形成一条纵行的上皮细胞性小管，称为前肾管（pronephric duct）。除鱼类及两栖类动物外，前肾在脊椎类动物（包括人类）无任何排泄功能，并于第4周末开始逐渐退化，其前肾管下端继续向尾侧部延伸，形成中肾管（mesonephric duct），又称Wolffian管。

中肾的发生始于妊娠第24天（人类）、9.5天（小鼠）或11.5天（大鼠）。在人类胚胎发育过程中，自第4周始，位于胸、腰部体节的间叶中胚层细胞受到邻近前肾管信号诱导，增生分化形成完整的肾单位，包括含有毛细血管丛的肾小球及与之相连的成对排列的肾小管，又称中肾小管（mesonephric tubule）。成熟的远端肾小管的外侧端引流进入向尾侧延伸的中肾管，而中肾管尾侧部继续向下延伸，于第4周末与膀胱前体器官泄殖腔融合。人类的中肾并无明显排泄功能，至妊娠第3个月末已大部分退化，遗留中肾管及小部分中肾小管。前肾和中肾可视作两个独立的结构，当分化逐渐延伸至尾部，其头部即开始退化。在男性，性腺区域的中肾小管分化形成输精小管，中肾管则形成附睾及部分输精管；在女性，绝大部分中肾管及中肾小管完全退化，部分残留中肾小管形成卵巢冠及副卵巢（图1-1-1-1）。

二、后肾

后肾的发生始于妊娠第28天（人类）、10.5天（小鼠）或12.5天（大鼠），亦即中肾仍在发育之际，后肾已开始形成。成年肾脏完全是在后肾基础上生长、发育、分化而来。初始形成的后肾由输尿管芽、生后肾间充质组织及基质细胞三部分组成。

1.输尿管芽（ureteric bud，UB）

系由Wolffian管尾侧端的上皮细胞受到位于其周围的间充质细胞信号诱导，向其后侧凸出生长，侵入生后肾间充质组织而形成。初始形成的UB呈“T”形对称分布，UB向外周皮质部不断延伸，形成适应于肾脏整体结构的UB分支树。肾内叶间血管及小血管的分支模式与UB分支十分类似。人类肾脏发育过程中，UB反复分支约15次，至孕20～22周，分支基本完成。UB分支的起始部分及初始分支，分别形成肾盏、肾盂、输尿管及膀胱三角区组织，而其分支的终末端部分形成肾单位的集合管，并与间充质细胞分化而来的远端肾小管融合。

2.生后肾间充质组织（metanephric mesenchyme，MM）

系由位于Wolffian管尾端周围呈弥散性分布的、来源于间叶中胚层的间充质细胞，经UB信号诱导，聚集并增殖而成。这种UB与MM之间互以对方为条件相互影响分化的现象，称之为相互诱导作用。目前，MM与UB细胞相互诱导作用的细胞和分子机制，是肾脏发育生物学研究的中心环节和热点领域。一方面，UB细胞信号诱导MM细胞聚集、增殖、分化，最后形成肾小管上皮及成熟肾单位（nephron），此过程称之为间充质-上皮细胞转化（mesenchymal-to-epithelial transformation，MET）；另一方面，MM信号诱导UB不断分支、分化，并规范其分支发生的空间位置，形成集合管、肾盏及肾盂，此过程称之为UB分支的形态发生（ureteric bud branching morphogenesis）。

如图1-1-1-2所示，弥散分布于UB分支顶端周围的未被诱导的MM细胞，在UB信号的诱导作用下分裂增生并聚集成团，形成以UB为中心的帽状细胞聚集体（condensation）；每个聚集体最初诱导分化而形成的间充质来源的具有上皮细胞特征的管腔样结构，称为肾小囊（renal vesicle），肾小囊细胞进一步增生分化形成特征性的逗号小体（comma-shaped body），继而再延长成为“S”形小体（s-shaped body）。一般而言，“S”形小体已具有明确的肾小管上皮的结构特征，可分为三个节段：远离UB端部分的上皮细胞继续增殖并分化，形成足细胞及Bowman囊，伴随出现内皮细胞侵入及毛细血管的形成，最后与新近形成的足细胞和Bowman囊一起形成肾小球；中间段分化成近曲小管；近UB端依次形成髓襻（Henle’s loop）降支、升支及远端肾小管，进一步与输尿管芽分支的终末端相连接（图1-1-1-3）。

3.基质细胞（stromal cells）

可能由某部分特定的MM细胞分化而来，广泛分布于胚胎肾脏的皮质、髓质部分及UB茎部周围，最终形成肾脏薄膜以及肾间质和纤维结缔组织，在肾脏发育过程中具有其独特作用。

在人类肾脏发育过程中，妊娠第9周开始形成后肾来源的肾小球；在孕22～34周，形成周边的皮质区和中央的髓质区，髓质区无肾小球，皮质区的集合管可继续诱导间充质细胞。第28周左右UB分支即到达外周皮质部分，但新的肾单位形成一直延续至妊娠第36～38周，最后每侧肾脏形成0.7百万～1.0百万个肾单位。生后肾小球进一步肥大，约3.5岁达成人肾小球大小。由于后肾发生起始于中肾脊尾侧部，故肾脏的原始位置位于盆腔内。随着胚胎腹部的生长与UB分支的不断延伸，尤其是腰骶椎的不平衡生长，肾脏位置逐渐上升，至胎儿出生时已升至腰部。自第10周左右开始，人类胚胎肾脏开始产生尿液，其尿液进入羊膜腔后与羊水混合，经胎儿消化道吞咽后进入体内，然后经肾脏排泄而形成再循环。整个妊娠期间，母体胎盘代替肾脏行使其排泄代谢产物的功能，肾脏本身基本上不具有排泄废物的作用。

小鼠和人类肾脏发育的解剖结构相似，但因人胚胎期约40周，而小鼠孕期仅20天左右，故发育过程中的时间分点存在不同。小鼠后肾发育约开始于胚胎第10.5天，肾小球形成于胚胎14～15天。人类孕36周肾单位的发育基本完善，而小鼠肾脏的发育持续至生后一周。在解剖学上两者亦存在一些不同。人类中肾拥有含毛细血管袢的肾小球，小鼠中肾时期出现的则是退化的肾小球簇。足月新生儿每个肾脏具有约0.7百万～1.0百万个肾小球[1]，鼠类每侧肾脏则成比例地具有较少的肾小球。人类肾盂具有多个肾乳头，小鼠肾盂则仅有一个肾乳头。

第二节　肾脏发育的细胞生物学机制

肾脏发育的主要细胞来源是后肾中Wolffian管来源的UB上皮细胞和间叶中胚层来源的MM细胞。两者相互诱导，经过一系列的细胞增殖、死亡、迁徙、分化及形态发生过程，最后形成成熟的肾脏。

一、肾脏发育时的细胞增殖与凋亡

肾脏发育时期，细胞增殖在后肾生肾皮质区的输尿管芽分支顶端和邻近的间充质细胞中表现明显。肾间充质干细胞可能存在于该区域，这些细胞可分化为肾单位上皮或间质细胞。早期研究认为成熟肾脏中不存在干细胞。近年来的研究表明成年肾脏髓质基质细胞的少部分细胞亚群可能为干细胞，它们为肾毒性中肾单位上皮的再生提供细胞来源[2]。

细胞增殖的同时，新近形成的肾小管上皮细胞周围可观察到大量的细胞死亡现象，亦即程序性细胞死亡（programmed cell death）或称细胞凋亡（apoptosis）。这种细胞死亡是一个主动过程，与肾脏发育过程中的形态发生及细胞选择有关。事实上，正常肾脏发育中前体肾单位邻近的间充质中均存在一定程度的细胞凋亡，以调控每个小管中的细胞数目、形成肾单位的数目及邻近基质/间质细胞的密度。凋亡细胞通过钙依赖的内切酶降解基因组DNA等机制发生核固缩和碎裂，进而发生凋亡。发育中的肾髓质也存在凋亡，研究表明凋亡参与Henle袢升支细段的形态形成[3]及去除集合管中过剩的β闰细胞[4]。凋亡也参与肾小球发育中毛细血管的形态形成，对管腔的形成起关键作用[5]。

因此细胞增殖与凋亡维持良好的平衡才能保证正常肾脏发育进行。过度的增殖可导致赘生物形成（如Wilms肿瘤）和囊性结构形成（如囊性肾病）。相反，过度的凋亡可导致肾脏生长的减缓，肾单位数目减少（如肾发育不全）或后肾发育退化（某些肾发育异常）。

二、肾脏发育时的细胞分化

每个肾脏前体细胞经过分化达到专一化。例如，一些肾间充质细胞分化为原始的肾单位上皮细胞，而其他的则分化为基质细胞或间质成纤维细胞[6]。前体细胞形成“终末分化”细胞，在成熟器官中行使特定的功能。

后肾发育中特征性的MM转分化过程至少分两步完成：①防止细胞凋亡发生：体外实验证实，自UB条件培养基中分离纯化的可溶性细胞因子（如FGF2、FGF9、TGFα、TIMP1/2等）具有使MM不发生细胞凋亡的作用[7-9]；②细胞增殖及转分化：在防止细胞凋亡发生的基础上，UB来源的诱导因子及自身表达的基因及其产物（如LIF、Wnt4、BMP7等），进一步诱导其增殖和分化，形成成熟的肾单位[10-12]。

三、肾脏发育时的形态发生

形态发生指的是不同细胞群形成复杂三维构型的发育过程。例如，肾间充质细胞形成肾单位小管；输尿管芽不断分支形成集合管系统。在脉管及血管生成中也存在形态发生过程。

第三节　肾脏发育的分子生物学机制

随着胚胎肾脏基因库的建立以及大量胚胎肾脏基因芯片分析结果的问世，结合体外原位杂交及体内基因敲除实验，对于特定时间、空间位置上基因表达及功能调节机制已经有了深入了解。目前，研究者们仍在寻找胚胎期肾脏不同类型细胞的特征性基因表达，以期绘制出发育肾脏的基因图谱。

一、影响肾脏发育的生物大分子

约有数百种基因及蛋白质在肾脏发育过程中表达，包括各类转录因子、生长因子及黏附分子等。

1.转录因子（transcription factor）

一般位于细胞核内，直接或间接与DNA调控元件结合，以控制基因的转录水平。到目前为止，较重要的影响后肾发育的转录因子包括：①同源异形核基因（homeotic genes），该类基因在脊椎动物主要控制肾脏与其他器官的空间位置及肾小管节段形成（如Hox、pax、Emx2、foxd、Lim1基因等）；②锌指因子（zinc-finger transcription factor），系一组含有形状如手指且以锌原子及组氨酸、半胱氨酸络合结构为中心的结构域单元的转录因子（如WT1）；③原癌基因（proto-oncogenes），如myc家族、ros、ETV4/ETV5等；④其他转录因子，如formin、Pod1等。

2.生长因子（growth factor）

参与肾脏发育的细胞增殖、分化及形态发生。影响肾脏发育的生长因子主要通过自分泌或旁分泌作用，与邻近靶细胞表面的不同特异性受体结合，将其细胞信号传递进入细胞内，经第二信使发挥生物效应。这些生长因子主要包括：①与UB分支及形态发生相关：包括表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）、转化生长因子α（transforming growth factor alpha，TGF-α）、成纤维细胞生长因子1或7（ fibroblast growth factor 1/7，FGF1/7）、胶质细胞衍生神经营养因子（glial cell line derived neurotrophic factor，GDNF）、肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）、胰岛素样生长因子1和2（insulin-like growth factor 1/2，IGF1/2）及多效生长因子pleiotrophin（PTN，亦称作肝素结合的神经营养因子，HBNF）等；②促进MM增殖及转分化：包括FGF2或FGF9、TGFα、IGF1/2，以及白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）、Wnt1/4/7b、骨形成蛋白7（bone morphogenetic protein7，BMP-7）；③其他类，包括血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、血管生成素1/2（angiopoitin 1/2）、血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）、血小板衍生生长因子（platelet derived growth factor，PDGF）、神经生长因子（nerve growth factor，NGF）及神经营养素3（neurotrophin 3）等，分别与肾脏血管内皮细胞、系膜细胞及基质细胞等的增殖及分化有关。此外，部分细胞因子，如TGFβ、BMP4、activin及肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）等，则具有抑制细胞增生及分化的作用；这些分子的重要性在肾脏发育畸形中尤其突出。还有一些因子，如BMP4在生长和分化过程中具有正向及负向双重作用，其依赖于所研究肾脏系统形态发生的特定时期。一些因子由于可结合至不同的受体具有多种作用，如Ang Ⅱ通常通过作用于Ⅰ型受体（AT1R）促进生长，亦可通过作用于AT2R诱导凋亡[13]。

3.黏附分子及细胞外基质

存在于细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的黏附分子，广泛参与细胞与细胞、细胞与ECM、细胞与细胞因子之间的相互作用，从而影响MM的增生分化及UB分支生长及形态发生[14]。黏附分子大致分为：①细胞与细胞间黏附分子，如神经细胞黏附分子（neural cell adhesion molecule，NCAM），其黏附性不依赖于钙；E-钙黏素（E-cadherin），其黏附性依赖于钙，等；②细胞与细胞外基质间黏附分子，包括胶原蛋白（collagen）、层粘连蛋白（laminin）、细胞黏合素（tenasin）、巢蛋白（nidogen）、纤连蛋白（ fibronectin）、entactin和vitronectin等；③蛋白糖苷类：如蛋白糖苷、硫酸肝素蛋白糖苷（heparan sulfate proteoglycan，HSPG），该类黏附分子具有与多种细胞因子结合的功能，进而储藏这些细胞因子，调控它们与受体酪氨酸激酶的结合；④金属蛋白酶类及其抑制剂：如金属蛋白酶2/9（metalloproteases2/9，MMP2/9）、尿激酶（urokinase）、组织金属蛋白酶抑制剂1/2（tissue inhibitor of metalloproteinase1/2，TIMP1/2）等，与UB侵入MM、形态发生及肾单位形成有关。许多黏附分子是通过整合素受体结合至细胞表面，为小管上皮和内皮的空间构型提供物理框架。

二、输尿管芽发育及其形态发生

UB发育过程包括UB的产生，侵入MM的初始阶段、树状分支形成及形态发生、UB上皮细胞分化成熟以及终止分支发生的全过程。UB形态发生与其他上皮性组织（如肺、腮腺及前列腺等）的发育过程十分类似。MM来源的信号、UB自分泌信号及基质细胞信号协同作用，诱导UB的形成、生长及形态发生。

1.UB的初始形成

随着Wolffian管向尾部延伸，邻近的MM信号分子诱导其一侧的上皮细胞向外凸出生长，形成UB的起始部。调控UB在适当部位萌发及生长的机制包括：①许多生长因子通过受体酪氨酸激酶促进生长发育；②转化生长因子TGF-β亚家族成员发挥重要的抑制作用。多种因子参与UB的产生，其中GDNF/Ret的作用最为关键。Ret是一种受体酪氨酸激酶，表达于中肾导管、输尿管芽和分支。GDNF主要由MM产生，其激活Gfra1/Ret受体酪氨酸激酶复合物，触发Wolffian管和UB上的Ret阳性细胞向GDNF阳性细胞生长，启动UB的萌发，促进UB分支形成。此外，GDNF激活Ret受体酪氨酸激酶还需要存在于MM、UB和Wolffian管上皮细胞表面的GFRα1的协同参与。GDNF基因敲除的突变小鼠由于UB外生受到抑制导致肾脏发育异常甚或双肾缺如；过表达GDNF则诱导异位UB形成。其受体GFRα1和Ret基因敲除的小鼠肾脏表型也与GDNF突变鼠类似。细胞中Etv4和Etv5的缺失，表现类似Ret-/-细胞[15]。近期Ret的杂合子突变在人类中得到鉴定，表现为双侧肾发育不良[16]，有个案报道一种罕见的Ret多态性，表现为原发性非症候群的膀胱输尿管反流[17]。

肾脏发育的早期阶段，Wolffian管、UB及MM表达的多个转录因子（如Pax2、Lim1、Sall1、Six1、Eya1、Hox11、Fras1、GDF11及ITGA8/ITGB1等）通过不同的作用途径和位点影响GDNF或Ret受体的表达水平，该信号通路又可通过调控Etv4/Etv5和SOX8/SOX9调节下游靶基因（如Cxcr4、Dusp6、Met及Spry1等）的表达，从而影响UB的形成。在上述转录因子突变的转基因动物，由于影响GDNF/Ret表达，致UB发生异常而具有肾脏发育异常的表型。研究显示正常肾发育中，输尿管芽中的Pax2可上调Ret表达；肾间充质中亦表达Pax2，其结合至GDNF启动子，促进GDNF表达[18]。将Pax2两条等位基因均敲除，输尿管芽则不能从Wolffian管萌发。β-catenin是一种转录因子相关分子，表达于输尿管芽，是分支形态形成过程中所必需的，其可诱导Lim1, Pax2, Ret和Wnt11。亦有资料显示WT1的缺失可导致UB发育失败，但未影响GDNF或Ret的表达[19,20]。

在UB形成初始阶段，BMP4系目前已知为数不多的限制UB生长的因子之一。在正常发育过程中，BMP4表达于Wolffian管周围较宽的范围，而不是正常输尿管芽萌发处，可能与其抑制异位分支形成相关，BMP4也可提高输尿管的延伸及参与输尿管的肌化。BMP4可能具有抑制GDNF表达的作用，若去除BMP4的抑制效应，可导致异位UB的过度生长。近期，报道发现人类BMP4的突变具有肾束发育畸形[21]。BMP4的活性受另一个分泌因子gremlin-1的调控，gremlin-1可抑制BMP4的活性[22]。

2.早期UB分支的形态发生

UB侵入MM后进一步分支，在小鼠E11.5～E15.5，UB经历约9级分支，产生含有350～500个芽顶端的树状结构，在此过程中，主要依赖UB与MM之间的相互作用。UB上皮诱导MM的同时，MM传递大量的细胞信号，诱导UB的形态发生。有学者[23]将UB与肺间充质共同培养，UB则形成较多侧枝，纵向分支较少，提示后肾MM不但促进UB分支，而且可能通过局部表达不同的促生长或抑制生长因子调控UB的分型，即进一步分化为肾脏、肺等不同器官组织。早期发育肾中的细胞空间分布亦有差异：MM细胞分布于UB芽顶端周围，促进生长及分支，肾单位上皮细胞及基质细胞则围绕于UB茎部周围，促进其进一步延伸而抑制分支。UB顶端和茎部也表达不同基因，例如Ret和Wnt11表达于芽顶端，Wnt7b则表达于茎部。

在UB分支发生早期阶段，MM来源的GDNF及UB分支顶端Ret表达水平（图1-1-3-1）对维持UB细胞的增殖和分化至关重要。MM中GDNF或UB顶端Ret表达抑制，将阻碍UB分支生长及形态发生。此外，基质细胞表达的维生素A受体RARα/RARβ2及转录因子Foxd1和Pod1对于维持UB分支顶端Ret表达也至关重要。RARα/RARβ2、Foxd1或Pod1基因敲除的纯合子小鼠，由于Ret表达受影响而导致UB分支明显减少，继而出现肾单位形成减少、肾单位体积缩小的表型[24-26]。

尽管分离的UB培养必须依赖GDNF的存在，但仅加入GDNF并不足以诱导UB的形态发生，提示除GDNF外，仍有多个因子参与，并形成复杂的分子信号网络，精确调控UB的形态发生，如，Sprouty-1通过ROBO2/SLIT2信号通路阻断异常输尿管芽的萌发。值得一提的是：在少部分家庭中发现ROBO2基因突变，表现为多种原因引起的膀胱输尿管反流或重复肾。此外，部分FGF家族成员（如FGF1、2、7、10）对UB分支的生长也具有明显的调节作用。MM来源的HGF、EGF受体配体（如EGF、TGFα、amphiregulin）等在体外实验中均具有促进UB或集合管细胞株分支生长的作用[27]。

除上述可溶性细胞因子及转录因子外，位于UB上皮及MM之间的黏附分子对于UB的形态发生具有重要的调节作用。输尿管芽的茎被Laminins、Ⅳ型胶原、nidogen/entactin和细胞黏合素tenascin组成的基底膜环绕。分支的上皮暴露于富含collagenⅠ和Fibronectin的肾间充质基质，Fibronectin可对抗基质Laminin，促进增殖[28]，与观察到的分支顶端细胞具有最快的增殖速度是一致的[29]。LAMA5突变可能导致肾缺如。足细胞中整合素integrin α3（ITGA3）与integrin β1（ITGB1）亚基形成功能二聚体，简称α3β1整合素二聚体，在肾单位的发育中起重要作用，小鼠中ITGA3敲除，导致髓质集合导管数目减少[30]。HSPG广泛存在于MM及UB细胞表面及ECM内，不同的细胞因子（如GDNF、pleiotrophin、HGF及FGF家族成员）与HSPG不同部位的硫酸肝素结合，影响UB的分支生长。硫酸肝素2-磺基转移酶（heparan sulfate 2-O-sulfotransferase，Hs2st）为HSPG合成的关键酶，该基因突变小鼠由于HSPG合成缺失导致双侧肾脏缺如[31]。此外，UB分支侵入MM的过程中，消化溶解其分支顶端ECM的金属蛋白酶活性（如MMP2、MMP9及尿激酶等），这对于UB分支形态发生亦至关重要[32]。

在人类，一些黏附分子发生突变可导致先天性或遗传性肾脏疾病。Anosmin-1蛋白覆盖于输尿管芽及其分支的表面，调节生长因子的活性。编码anosmin-1蛋白的基因KAL1突变可导致X连锁相关Kallmann综合征中的肾发育不良。FRAS1（Fraser syndrome 1）和FREM2（FRAS1-related extracellular matrix）是插入至胞质基底膜上的大分子、多区域蛋白，向胞外突出，并形成复合物，调控肾发育中生长因子的表达和活性。无论是小鼠或人类该基因的突变常与Fraser综合征中的肾发育不全相关。类似地，glypican-3是一种输尿管芽相关细胞表面硫酸类肝素蛋白多糖，可能是通过调控BMPs和内皮抑素的活性调节UB分支的速度[33]；人类GPC3突变与Simpson-Golabi-Behmel综合征中肾脏囊性畸形相关，它是一种X连锁遗传，特点为产前和出生后过度生长、内脏和骨骼发育畸形[34]。

3.UB分支发育的成熟及终止

UB逐渐延伸及分支，其远端最终发育为集合管，近端接近起始部最终分化为输尿管。在小鼠E15.5，许多UB的分支顶端与胚胎肾单位的连接导管相连。到目前为止，有关UB分支成熟及终止的机制尚不明了。

Wnt（wingless-type MMTV integration site family）糖蛋白是一种分泌型信号因子。Wnt7b和Wnt9b共同调控髓质和肾乳头形成过程中的细胞分布；Wnt7b表达于UB茎部，Wnt7b突变鼠表现为严重肺发育不全、髓质和肾乳头不发育[35]；Wnt9b的表达贯穿整个UB阶段，诱导早期的UB分支及随后的集合管延伸，Wnt9b突变鼠中Wnt11和GDNF表达下降，UB分支紊乱，但具体机制尚待进一步阐明。髓质和肾乳头集合管的形成需Wnt7b、HGF、EGF和laminin等信号的共同作用。

集合管的主细胞、α和β闰细胞均来源于UB细胞的增殖及分化。集合管来源的克隆细胞胞外基质中分离纯化的生物大分子Hensin具有调节闰细胞分化及极性形成的作用[36]。Galectin-3是一种细胞黏附分子，主要表达于成熟的集合管茎。其可能通过与Laminin及其他细胞外基质分子相互作用调控上皮的生长[37,38]。Galectin-3蛋白也表达于初级纤毛，Galectin-3的下调可增加常染色体隐性遗传多囊性肾病小鼠模型中囊的形成[39]。在人类常染色体显性遗传多囊性肾病中，Polycystic kidney disease 1（PKD1）是最常突变的基因，其显著表达于胎儿集合管[40]。

胎儿集合管还表达多种转录因子，它们在成熟中起重要作用。例如，p53与集合管扩张相关，p53可在转录水平调控PKD1；肝细胞核因子（hepatocyte nuclear factor 1β，HNF1B）常上调一些抑制囊性病变的基因，包括在人类常染色体隐性遗传多囊性肾病中的突变基因，HNF1B的下调引起的多囊肾亦与延伸的小管上纺锤体的正常纵向排布下调相关[41,42]。该基因可能也调控小管生物功能，其突变与胞质内尿酸水平增高及低镁血症相关[43,44]。

随着UB不断分支延伸进入外周皮质，其分支顶端Ret表达开始下降，被诱导分化的MM分泌GDNF减少，转录因子Pax2表达降低，因而促进上皮细胞生长的信号减弱，细胞增生速率减慢；另一方面，分化成熟的肾小管及基质细胞来源的负反馈信号可能逐渐增强，最后导致UB分支逐渐减慢，直至停止。体外器官培养结果显示，TGFβ超家族成员（包括TGFβ1、TGFβ2、BMP2、BMP4和activin）对于胚胎肾脏及细胞株的生长（尤其是UB）均具有明显的抑制作用。但是，TGFβ1和activin的基因敲除鼠却没有明显的肾脏发育异常[45-47]。

三、后肾间充质细胞诱导分化及肾单位形成

1.基本过程

MET及肾单位的分化成熟主要依赖于多种UB信号分子的诱导、基质细胞及自分泌信号的调节。最初，未被诱导的MM表达vimentin、fi bronectin、神经细胞黏附分子（NCAM）等标志蛋白；初始阶段被诱导的间充质细胞，开始表达WT1、Pax2、Wnt4、Nmyc、integrin、Bcl-2等与细胞聚集体形成有关的蛋白（图1-1-3-2）。随着MM的进一步分化及肾小管上皮细胞结构如肾小囊、逗号小体及“S”形小体的形成和细胞极性的出现，Ⅳ型胶原、细胞角蛋白（cytokeratin）、Laminin α1、E-cadherin及紧密连接蛋白ZO-1等上皮细胞标志蛋白的表达逐渐增高；最后，随着肾小球足细胞的成熟，则出现podocalyxin、刀豆血凝集素（peanut lectin）等足细胞的标志蛋白。

2.后肾间充质细胞的密集

肾单位形成的第一步形态学变化是肾间充质细胞聚集，同时，这些生肾前体细胞经历爆发性增殖，上调转录因子WT1和PAX2的表达[29]。PAX2阻碍肾脏细胞发生凋亡[48]，应用反义寡核苷酸抑制PAX2的表达可阻碍培养的后肾间充质细胞的凝集[49]。小鼠中PAX2基因拷贝缺失可导致小肾脏[50,51]，人类PAX2基因杂合子的突变可导致肾脏-虹膜缺失综合征中肾脏发育不全[52]。其他在间充质密集过程中可被双向调控或上调的基因有HGF的受体Met[53]，整合素α8（Integrin alpha 8，ITGA8）[54]和Bcl-2[29]。HGF表达于肾间充质细胞，Met表达于UB及发育的集合管上皮细胞，两者结合除可诱导分支形态形成，亦可诱导间充质凝集物中上皮标记分子的表达。小鼠ITGA8表达于输尿管芽分支表面，在协调肾间充质凝集物与输尿管芽上皮间构型方面起重要作用[55]。ITGA8缺失表现为肾单位及输尿管芽分支发育缺陷，双侧肾脏严重发育不良，导致常染色体隐性遗传性肾病。Bcl-2位于核内和线粒体膜上，可能通过干扰脂质过氧化抑制凋亡。它的纯合子突变小鼠表现为发育过程中突发性肾凋亡，形成肾发育不良[56,57]。这些分子间组合可提高间充质细胞在转化为肾单位上皮细胞前的存活、生长和分化。

3.后肾间充质细胞-上皮细胞转分化及肾单位小管的形态形成

约在小鼠妊娠第12.5天，间充质凝集物形成一管腔结构，在经历肾小体、逗号小体、“S”小体阶段后逐步分化为成熟肾单位[58]。这个过程与足细胞以外的所有节段中cytokeratin替代vimentin相关。此外，黏附分子的表达也发生巨大变化。当E-cadherin出现在原始肾单位的细胞与细胞间连接时[59]，NCAM表达下调[60]。多项研究表明E-cadherin参与上皮细胞的形成[61,62]。同时，细胞外基质分子collagenⅠ和fibronectin的表达下降，原始肾小管上皮细胞开始形成含有Ⅳ型胶原、Laminin、heparin sulfate及nidogen[59,63]的基底膜。器官培养实验表明Laminin-1（一交叉型三聚体）和ITGA6（一种细胞表面受体）间的相互作用是原始肾单位管腔形成所必需的[59,64]。

WT1最初是作为肾脏Wilms瘤抑制基因的发现而得名[65]，此后证明，WT1在肾脏MM细胞增生、MET、肾小球足细胞发育及维持成熟肾小球足细胞功能方面，均具有重要作用[66]。WT1在前、中肾及尚未诱导分化的MM中即已开始表达，并在MM形成初始阶段维持低水平；随着UB信号诱导，增生聚集的MM细胞中WT1表达开始增高，逗号小体及“S”形小体则明显增高；在发育成熟的肾单位中主要局限于足细胞。WT1突变小鼠，由于UB肾脏缺如、间充质细胞增生障碍，导致肾脏发育严重异常，甚或双肾缺如[67]。WT1的表达水平增高是MM被诱导的重要标志，亦即WT1提供MM对UB信号发生增殖反应的分子基础[67]。资料显示，Pax2与WT1可相互调节，即Pax2可激活WT1操纵子，而WT1抑制Pax2表达。WT1和Pax2双突变的杂合子小鼠，其肾脏体积较野生型小50%[68]。

Wnt可通过经典的WNT/CTNNB1[69]及非经典的WNT/PCP[70]信号通路作用于肾脏发育。Wnt4主要表达于MM（图1-1-3-2），刺激MM发生上皮细胞转分化，并认为是MET发生的必要条件。人类Wnt4基因突变可形成肾发育不良、Mullerian导管衍化异常及女性男性化综合征[71,72]。目前多数学者将Wnt4视为MM开始发生转分化的重要标志[12]。Wnt1是第一个被发现能够在体外诱导MET发生的Wnt家族成员，但是在MM中未见表达。UB分支各部分均表达Wnt6，转染细胞分泌的Wnt6可诱导MM组织分化形成肾单位。Wnt11在UB顶端表达且与GDNF/Ret功能调节有关，尽管Wnt11表达细胞在体外器官培养实验中并不能诱导肾小管上皮的形成，但是Wnt11基因敲除的小鼠由于UB分支发生异常继而呈现肾单位发育不良的表型[73]。

一些其他类型的分子也参与原始肾单位的生长。BMPs属于TGFβ亚家族成员，通过Ⅰ型和Ⅱ型受体丝氨酸/苏氨酸激酶转导生长信号。BMP7是WT1的重要靶基因之一，高表达于早期胚胎发育肾中的祖细胞、UB上皮细胞及成熟足细胞。BMP7基因敲除小鼠肾单位数目及输尿管芽分支明显减少。LIF属于IL-6家族，由输尿管芽分泌产生，可与FGF2和TGF家族成员共同活化，促进后肾间充质细胞向上皮细胞（包括近端小管上皮和肾小球）转分化[10,74]。其他的生长因子，如IGFs，在肾脏发育的此阶段作用相对较弱[75]。

4.近-远端肾小管分型

肾小体的形成仅是小管生成的初始阶段。肾小体需经历延伸，弯曲，分段及分化才能形成成年肾脏中具有功能的成熟肾单位，最终每个肾单位均分节段形成近端小管、Henle袢、远端小管和集合管。肾小管各节段可在分子、细胞及解剖水平进行区分，每个节段在维持水、电解质平衡中均具有特定的功能。肾单位的分节段对正常肾功能至关重要，特定肾单位节段的缺失可导致人类各种疾病，然而，调控肾单位分节段及近-远端极化的分子机制尚未完全阐明。

NOTCH信号是最早参与胚胎发育中调控细胞分化的信号，是近端肾小管分型所必需的。Notch1、Notch2和配体Dll1及Jag1均表达于肾小体。敲除Notch2和Jag1的小鼠，肾小体近端肾单位、毛细血管袢及系膜区的发育将缺失[76,77]。Megalin是近端肾小管上内吞受体，在肾小球滤过大分子的再吸收过程中发挥重要作用。肾脏特异性敲除megalin的小鼠虽能正常发育，但在维生素和矿物质的处理中存在多种缺陷[78,79]。近端肾小管中megalin的缺失与小分子量蛋白尿、尿中维生素D结合蛋白增加、全身维生素缺乏症、低钙血症和骨软化相关[80]。Ⅱ型磷酸钠共同转运体（NaPi-Ⅱa）位于近端肾小管的刷状缘，当megalin缺失时，甲状旁腺激素不能诱导刷状缘上NaPi-Ⅱa向内转运[81]。

POU转录因子（含POU结构域）brain-specific homeobox/Pou domain protein 1（BRN1，亦称作POU转录因子3）表达于肾小体和“S”小体的远端，最终表达于Henle袢升支粗段。它调控Henle袢的延长和阶段特异性标记分子，如尿调节素uromodulin（Tamm-Horsfall protein）、Na+-K+-2Cl-协同转运蛋白（NKCC2）和barttin（BSND）。Umod编码糖蛋白uromodulin，广泛用于成年远端肾小管和Henle袢的标记分子。Umod敲除小鼠虽无明显表型，但人类Umod突变则导致高尿酸血症肾病及2型髓质囊性肾病[82]。

内皮素（endothelin，ET）系统通过多种机制参与血压的调控。小鼠集合管中ET1肽段的失活可导致高血压，水钠排泄功能受损，抗利尿激素水平增高[83]。胞质顶端膜上的水通道蛋白2（Aqp2），表达于连接导管和集合管主细胞，是抗利尿激素调控这些节段水渗透的主要靶标。单纯集合管细胞中缺失Aqp2的小鼠虽可存活至成年，但表现为显著的多尿症和严重的尿浓缩功能障碍[84]。小鼠集合管特异性的核受体过氧化物酶增殖活化受体-γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）的失活表明顶端上皮钠通道（ENaC）-γ亚基的转录和ENaC调控的钠重吸收受PPARγ调控[85]。小鼠集合管上皮中蛋白Shh信号的失活导致肾脏发育不良，肾盂和输尿管积水[86]。

还有一些因子在肾单位特异性的非小球细胞（如近端小管、Henle袢和远曲小管）分化过程中发挥重要作用。斑马鱼胚胎（前肾）小管包含近端小管样节段，视黄酸（维生素A调控的）信号的下调可导致这一节段发育缺陷[87]。在小鼠后肾器官培养中，维生素A亦可诱导肾发育，超高水平维生素A的衍生物可影响胚胎肾脏的分化[88]，这表明适中的视黄酸信号是哺乳动物和鱼类肾脏发育所必需的。

四、后肾基质细胞与肾脏发生

后肾基质细胞是MM中一类富含细胞外基质的成纤维样细胞群；起初疏松分布于密集MM帽的周围，随着肾发育的进展，其交错分布于UB分支与肾单位祖细胞间，形成肾间质。成熟肾脏中，基质细胞可形成肾囊、肾间质、系膜和众多血管支撑细胞。目前对MM如何分化形成基质细胞、基质细胞在肾脏发生过程中的作用及基质细胞如何进一步分化仍知之甚少。

后肾皮质部分的基质细胞特异性地表达转录因子Foxd1、视黄醛酸受体β2（retinoic acid receptor β，Rarβ2）、Pbx1b及合成视黄醛酸所必需的视黄醛脱氢酶2（retinal dehydrongenase，Raldh2）等；髓质部位的基质细胞则表达转录因子Pod1、细胞周期调控基因p57Kip2和信号分子BMP4。研究表明BF-2结构域转录因子Forkhead-box d1（Foxd1）是基质细胞的特异性标记分子，敲除Foxd1基因的突变小鼠成熟肾单位数量及UB分子均明显减少[89]。敲除Pod1基因小鼠的肾脏表型与Foxd1敲除小鼠的肾脏表型十分类似[24]。基质细胞可通过视黄醛酸信号途径影响UB分支顶端Ret表达以及转录因子Foxd1和Pod1等的表达、参与UB形态发生、MET及肾单位形成的调节。GD3神经节苷脂表达于输尿管芽茎周围的基质细胞中，该蛋白的抗体可阻断输尿管芽的形态形成[90]。

同时敲除Rara和Rarb2基因的小鼠出现基质细胞分布异常、肾单位发育不良、肾积水及巨大输尿管等表现型，提示基质细胞和维生素A与UB发生及MM分化有密切关系[91]。有趣的是，在后肾发育的初始阶段，在器官边缘的一小部分细胞表达VEGF受体，这些细胞通过一未知的信号通路上调PAX2，进而诱导GDNF的表达[92]。

五、肾小球毛细血管、肾小球旁器及系膜细胞发生与肾小球形成

小鼠妊娠第13.5天，内皮细胞祖细胞侵入“S”小体内，毛细血管袢、系膜细胞、肾小球基底膜和足细胞等进一步分化发育，形成有功能的肾小球。

1.肾脏血管发生

有关形成肾脏血管系统的血管内皮前体细胞的来源及血管发生机制尚存在争议。胚胎期血管发生大致分为脉管发生（vasculogenesis）和血管发生（angiogenesis）。所谓脉管发生系由分布于胚胎各处的间充质细胞直接在原位增殖分化形成内皮细胞及其血管（如胚胎卵黄囊血管、主动脉的发生）；而血管发生则指已经发育成熟的毛细血管内皮细胞及小血管侵入其他部位经增殖、分支、重塑而形成新生血管的过程。

过去认为，肾脏血管发生系由肾外形成的血管或内皮细胞侵入发育的MM增殖、分支形成。原因在于体外肾脏器官培养实验中，尽管可以形成肾小管及肾小球足细胞等多种结构，但光镜及电镜检查均未发现毛细血管发生的证据。将肾组织移植至鸡胚尿囊绒膜内培养，结果发现新生肾小球毛细血管来源于作为培养宿主的绒膜，而非胚胎肾组织。近期研究发现某些形态学上未分化的肾间充质细胞表达内皮细胞特异性标记分子，包括血管生长因子受体、VEGF和血管生成素1（angiopoietin-1，ANGPT1）[93,94]。在中肾导管尾端周围的中胚层凝集物内及输尿管芽时期的肾间充质中可观察到内皮细胞的前体[93,95]。将flk-1杂合子敲除小鼠无血管的后肾移植入野生宿主中（包括植入至大鼠眼前房），均发现早期后肾可直接发育产生毛细血管内皮细胞[95,96]。

内皮细胞增殖及新生毛细血管袢侵入“S”形小体的肾小球囊，主要与诱导分化的MM细胞、成熟肾小管上皮细胞及新生的血管内皮细胞分泌的VEGF及血管生成素1的作用有关。体外实验证实，VEGF、血管生成素1及低氧环境可促进肾脏器官培养的毛细血管形成。未分化的MM细胞表达VEGFR-2（又称为flk-1）、VEGFR-1（亦称flt-1）和TIE1，这提示MM细胞为内皮细胞的前体细胞。发育的肾小球足细胞表达血管内皮细胞生长因子（VEGF-A），其与受体flt-1和flk-1结合，在诱导内皮细胞分化、毛细血管形成和小管上皮细胞增殖中发挥重要作用。足细胞不表达VEGF-A可导致严重的肾小球血管缺陷，而过表达VEGF-A可导致塌陷性肾小球疾病。后肾血管生长中也有其他分子的参与，包括膜受体Eph/ephrin家族，在细胞-细胞识别中起重要作用。研究表明后肾间充质包含有表达肾素的前体细胞，其作用于脉管系统，也作用于小管上皮[97,98]。有生物活性的Ang Ⅱ及其受体AT1R和AT2R也参与作用。在大鼠中研究表明Ang Ⅱ可促进体内肾小球内皮细胞的生长[99]。ANGPTs和TGFβ1可能是通过调节内皮细胞的存活参与肾小球毛细血管的形态形成。足细胞分化中BMP4的适量表达是肾小球簇正常发育所必需的；BMP4功能缺失可导致肾小球微动脉瘤和肾小球毛细血管袢塌陷；过表达BMP4可导致肾小球簇中内皮细胞的缺失。足细胞特异性基因Noggin是BMP的拮抗剂，功能与BMP4类似[100]。

2.肾小球系膜细胞发生

系膜细胞发生可能同样来源于后肾内特定的MM细胞，且血小板源性生长因子（platelet-derived growth factor-β，PDGFβ）及其受体为系膜细胞的分化所必须。肾脏发育早期，PDGF受体β即开始在未分化的MM及UB细胞表达；随着肾脏的发育，PDGF受体表达则主要集中在肾小球毛细血管、内皮细胞及系膜细胞，而发育成熟的肾小管上皮细胞阴性。在敲除PDGFB或PDGFB受体β基因的小鼠，其胚胎肾脏内系膜细胞完全缺如，同时伴有肾小球结构发育异常[101]。另有研究发现，敲除Notch2受体基因的新生小鼠，由于肾小球内皮细胞及系膜细胞功能严重缺陷而不能存活[76]。其他的生长因子信号在系膜细胞的发育中也起作用：如未成熟的系膜细胞表达HGF和Met。

3.肾小球旁器细胞发生

肾脏发育早期，许多新生的血管内皮细胞具有分泌肾素的活性，但最后仅局限于肾小球旁器细胞。将含肾素-绿色荧光蛋白的基因工程小鼠的胚胎肾脏移植至大鼠的眼前房培养，结果发现肾素分泌细胞的前体细胞来源于MM[97]。此外，有证据表明肾素-血管紧张素活性与胚胎肾脏血管发育、集合管和输尿管的成熟相关，并因其血管紧张素转换酶抑制剂的致畸胎作用而受到重视[102]。敲除血管紧张素原或血管紧张素转换酶基因的小鼠表型十分类似，均表现为低血压、肾乳头体积减小、肾盂扩张和类似于高血压肾硬化的损害[103,104]。在同时敲除Ang Ⅱ受体1A和1B的小鼠，肾脏表型与血管紧张素原敲除小鼠类似[105]。而敲除血管AT2R的小鼠，出现肾积水、输尿管扩张和膀胱输尿管反流及输尿管膀胱结合部梗阻等类似于先天性肾脏泌尿道异常（congenital anomalies of the kidney and urinary tract，CAKUT）的表现[106]。

4.肾小球的发生

肾小球的上皮细胞及毛细血管内皮细胞均来源于后肾MM细胞的分化。肾小球的形成经历一系列连续发育过程。“S”小体中侵入内皮细胞，形成杯状的肾小球前体部分和其内部的原始血管袢。血管上皮细胞、足细胞前体及紧密相连的内皮细胞开始分化，随着肾小球基底膜（GBM）在足细胞和内皮细胞交界处产生，肾脏开始行使滤过功能。足细胞开始延伸出一级和二级足突，足突间相互交错，形成一独特的紧密连接，即裂孔隔膜。足细胞及Bowman囊壁细胞发育起始于“S”形小体远离UB的一端。分离培养WT1/Pax2阳性的细胞集落，可在体外诱导分化形成以足细胞为基础的肾小球样结构，并与侵入“S”形小体内的毛细血管及ECM一起形成肾小球滤过结构。

许多转录因子如Pax2、WT1、pod1以及与细胞分化相关的maf-1（kreisler）等均与肾小球足细胞的增殖、分化及功能有关。WT1转录因子是维持成熟足细胞所必需的，在成熟足细胞中，WT1可下调Pax2的转录，过表达Pax2的转基因小鼠则患有先天性肾病综合征。人类WT1基因突变则引起Denys-Drash综合征或Frasier综合征，前者好发Wilms肿瘤，后者多伴有男性假两性畸形或性腺发育不全。敲除pod1基因的小鼠，出现足细胞形成障碍；而在maf1突变鼠，则表现为足细胞分化异常。此外，影响肾小球基底膜完整性的突变基因，同样可能出现肾小球结构异常。例如，LMX1B（LIM homeobox transcription factor 1）是另一个表达于足细胞的转录因子，人类杂合子突变可导致甲髌综合征中的肾小球性蛋白尿[107]。LMX1B突变裸鼠的肾小球中，Ⅳ型胶原的未成熟型，即胚胎α1和α2型，不能分化为成熟的α3和α4型，导致常染色体突变的Alport综合征；该转录因子同时也上调了人类Ⅳ型胶原α4基因（COL4A4）的表达[108]。Nephrin是细胞黏附分子免疫球蛋白家族的一种跨膜蛋白，是肾小球裂孔隔膜的关键组成部分；人类编码该蛋白的NPHS1基因突变可致先天性和晚期出现的激素抵抗型肾病综合征。Podocin是另一个足细胞重要蛋白，可将裂孔隔膜和细胞骨架相连，编码Podocin的基因NPHS2突变可导致常染色体隐性遗传的激素抵抗型肾病综合征。

当肾小球上皮成熟时，基底膜富含Laminin b2。Laminin b2突变小鼠生后不久即出现肾小球基底膜的通透性增加、蛋白尿形成，其可在足突融合和裂孔隔膜缺失等结构改变之前发生[109]。Pierson综合征患者的LAMB2基因发生了杂合子突变，早期即出现肾病综合征和小瞳孔（瞳孔括约肌发育不良）[110]。Laminin a5是另一个表达在肾小球基底膜上的蛋白，LAMA5突变小鼠中，在毛细血管侵入胚胎肾小球过程中Laminin a1不能向Laminin a5转分化，突变的肾小球缺乏内皮细胞和系膜细胞[111]。足细胞表达α3β1整合素二聚体，其在肾小球发育中亦起重要作用，整合素ITGA3或ITGB1基因的缺失可导致肾小球损伤。

第四节　人类基因突变所致的肾脏发育异常

一、肾脏解剖学发育异常与基因突变

先天性肾脏泌尿道畸形（congenital anomalies of the kidney and urinary tract，CAKUT）在娩出的婴儿（包括活产和死产）中发病率为0.3‰～1.6‰[112-114]，约占所有在胎儿期发现的畸形的20%～30%，是胎儿期通过B超等手段可检查出的最常见畸形[115]，其中约有30%的患儿同时存在其他肾外畸形。此外，30%～50%罹患终末期肾脏疾病的患儿起病原因为CAKUT[116]。因此，早期诊断及早期干预对减少肾脏损伤、阻止或延缓终末期肾脏疾病发生有着重要的意义。

基因突变和环境因素是导致CAKUT的两大主要病因，目前发现至少有70种由基因突变所致且具有肾外表现的综合征可同时合并CAKUT。基因序列或基因拷贝数出现异常都与CAKUT密切相关。环境方面，孕期暴露于致畸因素或营养缺乏可导致CAKUT的发生。例如，孕期使用血管紧张素转化酶抑制剂或血管紧张素Ⅱ受体抑制剂，可阻断肾发育过程中肾素-血管紧张素系统的正常上调，导致肾小球旁组织增生，近曲小管分化消失，皮质、髓质纤维化[117,118]。

常见的CAKUT有肾缺如，先天性肾单位减少症，肾发育不良（伴或不伴有肾脏囊性变），肾小管发育不全，胚肾迁移异常（包括异位肾和融合肾），泌尿道畸形等。

在肾脏发育初期，输尿管芽由中肾管长出，在毗邻的生后肾间质内分支。这一起始过程如受到阻碍，可导致双侧或单侧肾脏缺如。Potter综合征是合并肺发育不良的双肾缺如性疾病，表现为胎儿羊水过少，出现面部被挤压的特殊面容。同样的，单侧肾缺如亦常合并其他组织发育异常，如内耳发育不全，生殖道和中轴骨畸形。肾缺如的机制尚不清楚，可能是由多因素导致的发育异常。目前，通过对肾缺如胎儿及患儿的基因序列分析，已确认多个基因突变位点，如RET、GDNF[16]、ITGA8、CDC5L、SALL1等与肾缺如有关。同样的，敲除基因GDNF、RET、GFRα、PAX2或WT1的小鼠可出现肾缺如的表现。

先天性肾单位减少症是肾单位数目减低导致肾脏大小低于同年龄正常值两个标准差以下，但肾脏结构维持正常的一种先天性疾病。单纯性的先天性肾单位减少症较为少见，可能与TCF1、PAX2、EYA1、SALLI等基因突变有关。更常见的是合并肾发育不良或其他疾病，如HNF1B突变导致的先天性肾单位减少症合并多囊性发育不良肾[119]。先天性肾单位减少症合并肾外症状的疾病主要有肾-视神经盘缺损综合征（renal coloboma syndrome，RCS），鳃-耳-肾综合征（branchio-otorenal syndrome，BOR）。目前认为RCS是由于PAX2突变，阻碍了输尿管芽分枝时正常的细胞凋亡过程。BOR的热点突变基因包括EYA1、SIX1和SIX5。

肾单位肾痨（nephron ophthisis，NPHP）是最常见的常染色体隐性遗传性囊性肾发育不良病，主要表现为肾小管异常，肾间质炎症及纤维化。NPHP1是最常见的突变基因，此外还有NPHP2-14、IFT140、TTC21b、WDR19、MRE11、ZNF423和CEP164等其他基因突变。目前仍有70%NPHP患者致病基因尚不明确。

多囊性发育不良肾（multicystic/dysplastic kidney，MCDK）是肾脏出现多个不规则的不相通的薄壁囊腔，输尿管缺如或闭塞，患肾基本无肾功能，但有报道指出可能在萎缩的肾实质中残存有功能的肾组织。目前已有报道MCDK人群可能存在CHD1L、HNF1B、ROBO2或SALL1等基因的突变[120]。

多囊肾按其遗传特点可将其分为常染色体显性遗传多囊肾（autosomal dominant polycystic kidney disease，ADPKD）和常染色体隐性遗传多囊肾（autosomal recessive polycystic kidney disease，ARPKD）。ADPKD的致病基因为PKD1与PKD2。ARPKD发病与PKHD1基因突变有关。

肾小管发育不全（renal tubular dysgenesis，RTD）是指近端肾小管缺失或发育不全，散发和家族性病例均有报道，病因有遗传性和获得性两种。编码肾素、血管紧张素、血管紧张素转化酶以及Ang Ⅱ受体的基因出现突变，均可导致常染色体隐性遗传的RTD。获得性因素包括双胎输血综合征，先天性色素沉着病导致的严重肝病或孕期使用血管紧张素转化酶抑制剂或Ang Ⅱ受体拮抗剂。

异位肾和融合肾系胚肾迁移过程中出现异常所致。肾异位是指发育完好的肾脏未能达到腹膜后肾窝内的正常位置，常合并有肾盂输尿管连接部狭窄、膀胱输尿管反流等疾病。融合肾是指两侧肾相融合，最常见的是马蹄肾，常合并其他泌尿系统畸形[121]。基因突变所致的异位肾和泌尿道畸形常与其他CAKUT同时存在，在此不做赘述。

二、肾脏功能学发育异常与基因突变

许多患者在出生后不久即出现肾脏疾病，甚至很快进展为终末期肾病，不存在肾脏形态学异常，但生化学指标及肾活检病理均提示肾脏存在功能异常。本节着重探讨先天性肾病综合征、遗传性肾小管疾病与基因突变之间的关系。

先天性肾病综合征是指出生3个月内出现肾病综合征表现，出生4个月到1周岁出现该病被称为婴儿型肾病综合征。大部分原发性先天性肾病综合征是由于基因突变所致，其中最典型的是编码肾小球滤过屏障组成成分的基因出现突变而导致的大量蛋白尿。目前已经认识到的编码肾小球滤过屏障组成成分的致病基因有NPHS1，NPHS2，WT1，LAMB2，PLCE1，LMX1B，MOY1E，INF2，CD2AP，ACTN4，TRPC6，MYO1E，COL4A3、4、5等（表1-1-4-1），欧洲的一项大型队列研究结果发现约85%的先天性肾病综合征患儿存在NPHS1，NPHS2，WT1或LAMB2的基因突变[122]。

NPHS1定位于19号染色体长臂，编码特异性表达在肾小球足细胞裂孔隔膜上的跨膜蛋白nephrin。NPHS1基因突变是芬兰型肾病综合征的致病基因，几乎90%的芬兰籍患儿突变为以下两种类型：一是2号外显子上碱基缺失突变（Fin_major），其次是26号外显子的无义突变（Fin_minor），导致nephrin蛋白翻译被截断，蛋白错误折叠于内质网中而不能正常表达在裂孔隔膜上。该病患儿常有早产史或宫内窘迫史、大胎盘，出生3个月内出现典型的肾病综合征，激素治疗无效。此外，世界各地非芬兰籍患儿发生该基因的突变也时有报道，目前已发现的突变位点超过176个，分布在整个基因的各个部分。有多个报道提示NPHS1某些位点的突变可能不会完全导致nephrin表达缺失，因此会出现症状较轻甚至对激素部分敏感的肾病综合征表现，且不限定于出生3个月内即发病[123-125]。

NPHS2定位于1号染色体长臂，编码肾小球足细胞裂孔隔膜蛋白podocin。Podocin负责募集nephrin和CD2AP，将裂孔隔膜铆钉于足细胞足突之间。NPHS2是常染色体隐性遗传的家族性局灶节段性肾小球硬化的致病基因，也是先天性肾病综合征的重要致病基因。2006年四种相对常见的NPHS2无义突变（R229Q，G34E，A61V和A252V）被报道，其中R229Q在健康人群中的携带率为2%～4%，被认为是无害突变[126]。但进一步研究发现R229Q无义突变降低了podocin与nephrin的结合能力，与其他突变位点杂合突变，可能是大年龄儿童或成人肾病综合征激素耐药的病因之一[127]。在部分NPHS2基因突变的患儿中可同时检测到NPHS1突变，相比于单种基因突变，目前尚不清楚两种基因突变对疾病表型是否存在交互式的影响。

WT1位于11号染色体短臂，编码锌指蛋白家族成员Wilms瘤抑制因子1（Wilms’ tumor suppressor 1，WT1）。在肾发生过程中，WT1参与诱导间充质上皮转分化和肾单位的形成。在成熟肾脏中，WT1主要表达于足细胞，参与调节足细胞骨架蛋白。WT1突变主要导致泌尿生殖系统畸形和肿瘤发生。目前常见的相关疾病有：Denys-Drash综合征（DDS），Fraiser综合征和WAGR综合征。WT1基因错义突变通常导致DDS，Fraiser综合征与9号内含子剪接体供位突变有关，而包含WT1的染色体区段缺失则与WAGR综合征有关[128,129]。

LAMB2基因位于3号染色体短臂，编码层粘连蛋白的β亚基。层粘连蛋白参与启动肾小球基底膜的形成。LAMB2是Pierson综合征的致病基因。尽管Pierson综合征在1963年就被报道过，但直到2004年才被认识到是一种独立的疾病。之后，LAMB2突变与Pierson综合征的报道逐渐增多，研究人员回顾了2004—2010年间49例LAMB2突变的病例，结果发现8种错义突变和2种片段缺失是Pierson综合征的致病性突变，这些突变扰乱了高度保守的β2链，使之不能与其他亚基形成有效复合物[130]。利用LAMB2基因全敲除的小鼠进行实验，结果表明缺乏β2链的层粘连蛋白在肾小球基底膜上定位异常，导致阴离子电荷屏障异常，尿蛋白漏出增多[109]。

Alport综合征，又称遗传性肾炎，是最常见的遗传性肾脏病，由于编码Ⅳ型胶原的基因突变所致。临床上表现为眼、耳、肾病变，肾脏表现为血尿和进行性肾功能不全，眼睛表现为前球形晶体及黄斑中心凹周围微粒，耳部表现主要是高频神经性耳聋。Alport综合征有三种遗传方式：性连锁显性遗传、常染色体隐性遗传和常染色体显性遗传。性连锁显性遗传最常见，约占80%～85%，为X染色体上COL4A5基因发生突变；常染色体隐性遗传约占15%，主要是COL4A3或COL4A4基因突变；常染色体显性遗传较为少见，约占5%，为COL4A3或COL4A4基因异质性突变。

先天性肾小管疾病种类较为繁多，主要是由于先天性基因突变或缺失导致肾小管重吸收及分泌功能障碍，出现氨基酸尿、糖尿、水和电解质紊乱，酸碱失衡等疾病。遗传性氨基酸尿症按累及的转运途径分为5类，包括阳离子氨基酸尿症，中性氨基酸尿症，亚氨基甘氨酸尿症，二羧基氨基酸尿症和β-氨基酸尿症（小鼠）。原发性肾性葡萄糖尿症的特征为血糖及肾小球滤液内糖浓度正常的情况下，由于肾小管对葡萄糖重吸收障碍导致尿中排出过量葡萄糖。可分为三类，其中前两种最小肾糖阈均下降：A类肾性糖尿，又称经典型，血糖不高时，肾小管对葡萄糖的最大重吸收率也低于正常，为真性糖尿；B型：肾小管对葡萄糖最大重吸收率正常，但葡萄糖滴定曲线的曲线段延长，为假性糖尿；O型较为少见，肾小管失去葡萄糖的重吸收功能，由肾小球滤过的葡萄糖全部进入尿液[131,132]。氨基酸尿症和肾性葡萄糖尿症的相关基因突变见表1-1-4-2。

肾小管基因缺陷所致的水、电解质和酸碱平衡紊乱主要有低钾血症合并继发性高醛固酮血症（Batter综合征），钙、镁紊乱，低肾素性高血压合并低钾血症，假性低醛固酮血症，肾小管酸中毒，肾性尿崩症等。在此重点阐述肾小管酸中毒的相关基因突变。肾小管酸中毒是肾小管功能缺陷引起的代谢性酸中毒，由于近端肾小管对碳酸氢根离子重吸收障碍和/或远端肾小管分泌氢离子障碍所致的一组临床综合征。其主要表现为：慢性高氯性酸中毒、电解质紊乱、肾性骨病和尿路症状等。可以分为原发性和继发性，原发性者为先天性缺陷，多有家族史。肾小管酸中毒一般分4个临床类型：①远端肾小管酸中毒（RTA-Ⅰ）；②近端肾小管酸中毒（RTA-Ⅱ）；③混合型或Ⅲ型肾小管酸中毒（RTA-Ⅲ）（此概念近年来逐渐淡化）；④高钾型肾小管酸中毒（RTA-Ⅳ）。先天性远端肾小管酸中毒可划分为3种亚型：常染色体显性遗传（Ⅰa），常染色体隐性遗传伴（Ⅰb）或不伴（Ⅰc）耳聋，主要病因分别为编码远端肾小管闰细胞阴离子转换蛋白AE1，集合管闰细胞顶端氢离子泵的亚基ATP6V1B1和ATP6N1B基因发生突变。先天性近端肾小管酸中毒可伴或不伴有Fanconi综合征，孤立性的先天性近端肾小管酸中毒较为少见，筛查出的基因突变报道也较少，有病例报道编码碳酸氢钠共转运体NBC1的基因缺陷后可发生此病[133,134]。高钾型肾小管酸中毒的患者由于体内醛固酮缺乏或肾小管对醛固酮敏感性不够而出现高血钾症状。原发性肾上腺功能不足、先天性肾上腺皮质增生症以及孤立性的醛固酮缺乏症都可导致先天性醛固酮缺乏，基因缺陷导致的盐皮质激素受体和肾小管上皮钠通道功能障碍则会引起肾小管对醛固酮的抵抗。

第五节　干细胞及组织工程在肾脏病中的意义

一、干细胞向肾脏组织的分化及作用

研究发现发育成熟的肾小球、肾小管和间质中均存在干细胞或祖细胞，是肾损伤再生修复过程的驱动者。尽管尚不能将干细胞工程应用于临床肾脏疾病的诊疗，但对于肾脏的再生医学研究已经非常深入和具体。肾脏的再生医学策略主要包括：寻找并确立促肾脏生长因子，在胚肾或成熟肾脏中找到肾脏干细胞或祖细胞，利用骨髓源性干细胞、内皮细胞前体、肾脏原始干细胞等进行细胞治疗，利用胚胎干细胞或诱导多能干细胞研究肾脏发生及损伤的机制。

通过体外培养细胞和组织，构建肾脏损伤的动物模型，研究人员在肾脏修复过程中发现了许多潜在的促肾脏生长因子，如HGF、EGF、IGF-1、肝素结合的EGF样生长因子（heparin-binding EGF-like growth factor，HB-EGF）、PDGF、BMP-7和子宫致敏相关基因-1（uterine sensitizationassociated gene-1，USAG1）。但这些因子介导的肾脏修复机制目前尚不清楚，是否与激活内源性肾脏干细胞有关也需深入研究。

骨髓源性干细胞，包括血源性干细胞和间充质干细胞，具有分化为肾小管上皮细胞，系膜细胞，肾小球内皮细胞，甚至足细胞的能力。研究发现一位男性患者在接受女性供者提供的肾脏移植后出现急性肾小管坏死，其移植肾脏出现1%Y染色体阳性的肾小管上皮细胞，而在未发生肾小管坏死的其他男性患者中则未见此现象，说明骨髓干细胞在肾小管损伤时可迁移至肾脏[135]。但亦有研究表明肾缺血损伤模型中，富集到损伤肾脏的骨髓干细胞主要是通过旁分泌方式刺激肾脏原位细胞来参与损伤的修复过程[136]。因此骨髓干细胞是否能在受损的肾脏富集，是通过分化直接替代受损细胞还是刺激促肾脏生长因子产生来进行修复以及对肾脏的实际修复能力仍存在较大争议。

Fine等在慢性肾脏病肾活检标本中观察到肾间质血管的脱落和消失[137]，并提出慢性缺氧可能是肾脏纤维化、肾疤痕形成的机制之一。原发的肾脏疾病造成肾毛细血管损伤，引起血流减少，肾间质中氧供不足，促发肾间质纤维化、瘢痕形成，进一步导致间质中微血管消失，并加重瘢痕周围的缺氧，从而进一步减弱肾脏血供。研究发现通过重塑肾间质微血管结构，恢复血管完整性可恢复肾单位的氧供，延缓病程进展。外源性内皮前体细胞移植直接参与肾微血管的重构，血供的恢复使尚存部分功能的肾单位中的各种细胞恢复细胞特性和功能，肾脏原始干细胞功能也可得到恢复，参与修复过程。但单纯移植内皮前体细胞能否恢复受损肾单位的功能，阻止肾功能进一步恶化仍需进一步深入研究。

肾脏来源的干细胞是对肾脏中被认为存在分化潜能的细胞进行分离培养而来，其特性不完全相同，取决于细胞来源的种类和分离方法，共性部分在于均可生成特定类型的肾脏细胞，如足细胞和肾小管细胞等。目前在生物人工肾的构建中发挥重要作用。

胚胎干细胞作为具有分化全能性的细胞，在再生医学中具有重要的研究价值。ROSS等人分离出大鼠肾脏，进行保留细胞外基质的脱细胞处理，并重新种植胚胎干细胞后发现细胞外基质可直接诱导胚胎干细胞在肾小球，肾小管及血管内分化增殖[138]。但令人担忧的是，除了可分化为肾脏正常细胞，胚胎干细胞也可在肾脏中分化为肿瘤细胞[139]。此外，关于胚胎干细胞使用的法律和伦理问题阻碍着其在临床上的进一步应用。

Takahashi和Yamanaka在2006年首次把OCT3/4，SOX2，KLF4和c-MYC 4个关键基因通过逆转录病毒载体转入小鼠的成纤维细胞，使其变成多功能干细胞[140]，并获得2012年诺贝尔生理学或医学奖。利用多能干细胞构建肾脏细胞避免了胚胎干细胞带来的伦理学问题和排斥反应，但人工诱导多能干细胞分化为肾脏细胞的过程尚不完全成熟，在分化过程中仍存在致癌和异常基因表达的风险。

二、生物人工肾的组织工程构建与应用

尽管血液透析和腹膜透析技术目前已得到广泛开展，急慢性肾衰竭仍有较高的死亡率，并由于存在多种并发症，严重影响患者的生活质量。目前常用的肾替代治疗仅能替代肾小球的滤过功能，如果能够进一步替代肾脏物质转运，重吸收及内分泌等功能，那么肾替代治疗将更接近肾脏生理特点，能够改变目前急慢性肾衰竭的病程进展，这也是目前生物人工肾的发展目标。生物人工肾是由生物人工血滤器和生物人工肾小管辅助（renal assisted device，RAD）两部分构成。生物人工血滤器是在人工生物材料（如聚砜膜）的中空纤维腔内种植内皮细胞，使种植的细胞逃避宿主的排斥反应，并通过转基因技术，使之可合成并分泌多种肾源性物质。RAD是将肾小管细胞种植在管状纤维生物反应膜上，采用流动式培养，得到具有重吸收、转运及内分泌功能的人工肾小管。2003年由美国FDA批准的Ⅰ/Ⅱ期临床试验表明对急性肾衰竭伴其他多脏器衰竭的病人使用血透加RAD治疗时能保持稳定的心血管功能，肾功能有所改善，死亡率由预测的80%～95%下降至40%，并实现了谷胱甘肽降解和25-OH-D₃向1,25-(OH)₂-D₃的转变[141]。随后2008年Ⅱa期多中心随机对照临床试验进一步表明RAD有效降低了患者起病28天，90天和180天的死亡率[142]。但由于实验设计和RAD制备、质控方面存在阻碍，之后的Ⅱb期试验被叫停。

目前生物人工肾的构建和应用存在几个主要的问题和挑战亟需解决。首先，如何获得大量的种子细胞。RAD需要大量具有较强的自我更新及分化能力的干细胞作为种子细胞。目前已建立起从成年猪肾脏上分离和扩增近端肾小管前体细胞的技术，但因其存在潜在的传播异种病毒的风险，发展受到阻碍。因此催化了从人肾移植后的废弃组织中提取细胞技术的发展，但获取种子细胞的数量仍不能满足临床需要。其次，制造和维持RAD较为困难，RAD生产过程中无法耐受低温贮藏，给停止生产进行质控带来困难。保持恒温37℃运输和使用会延误治疗时机，提高治疗费用。RAD需要体外循环的血容量较大，操作复杂不易掌握，也给临床治疗带来不便，目前新型的生物人工肾上皮细胞系统可能是RAD的进一步发展方向。最后，调控RAD系统组织工程构建的因素，如细胞培养温度、培养液pH、种植的压力、血流剪切力及细胞因子等，对临床实际应用有着重要的影响。

（陈秋霞　车若琛　张爱华）

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