第三节 电穿孔技术的形成与演变

一、知其然，不知其所以然

1754年，法国物理学家Nollet（图1-21）在他的一本名为《特殊电现象原因探求》（Recherches sur les causes particulieres des phénoménes électriques）之中首次提出“不可逆电穿孔（irreversible electroporation，IRE）”之说，这是最早较为科学地描绘这一现象并建议采用“IRE”来定义这一现象的著作。他在自己的电场实验中注意到，在电场中，若在人类或动物的皮肤上施加电火花，局部就会产生一个红点，称为Nollet氏红点。到1998年，Reilly也报道了同样的现象，并且认为这种红点的形成是由于热损伤后皮肤角质层退变的结果。虽然在当时，热损伤引起红点的可能性不能排除，但接下来1999年Prausnitz及Vanbever的研究都证实了电穿孔引起皮肤红斑、红点较常见，是IRE引起皮肤毛细血管损伤，血管通透性增加，血液成分渗出而引起的。且在电穿孔情况下，静电所产生的热也不可能达到这种皮肤损伤的程度。

可以说，整个18世纪，科学界就生物体或生物材料的电现象学研究一直保持着浓厚的兴趣。事实上，在这一时期，有关电学及生理学方面的研究发现往往存在内在的联系。自1780年开始，意大利生理学家Galvani（图1-22）就发现，将一只死去的青蛙放置在铁栅栏上，再用一铜钩刺激该青蛙的脊髓，就会出现肌肉的收缩现象，他将这一现象解释为当时他认为的所谓“动物电”所致。后来，意大利物理学家、化学家Volta（图1-23）给出了较科学的解释：当两种不同的金属同时存在于同一种电解质中时（如青蛙的体液），就会产生直流电，从而刺激青蛙肌肉而出现收缩。他再将青蛙的体液换成浓盐水浸泡过的纸，也同样产生了直流电，这一发现及理论，直接催生了发电桩的发明。这也是第一个能够产生稳定直流电的发电设备，成为以后所有电磁发明的基石。

在1802年，德国物理学家、化学家、哲学家Ritter（图1-24）通过大量的电生理学实验发现一种后来被称为Ritter氏开放式破伤风（Ritter's opening tetanus）的现象，即当通过伸展的肌肉神经介体的强电流中断时，会偶尔出现肌肉收缩。这一现象在当时尚不知其原因，直到20世纪中叶，有人提出假说，认为是细胞膜的破坏崩解造成的，这一假说直接促使了我们今天所说的细胞电穿孔现象的发现。

针对IRE现象研究首次报道的学者大概要数Fuller。其在1898年的一篇《有关肯塔基州路易斯维尔市俄亥俄河净化的研究报告》中首次提到IRE现象。在他的报告中有一点值得注意，那就是多次高电压放电能够杀灭水样本中的细菌，所使用的全部电脉冲仅仅持续几分钟，而在这一过程中温度并没有升高，电解效应不能够完全排除。基于此研究发现，当时IRE还被应用于液体的灭菌消毒。Fuller报道的杀菌作用极有可能就是IRE的作用。

19世纪末，有关电学方面的医学治疗应用越来越多，许多都是基于电热效应及电化学现象，但关于强的、短的电脉冲的应用还没有。在19世纪晚期，有一本由Rockwell编写的书《电在内外科中的应用》，其中包括X线、芬森（Finsen，图1-25）氏光、振动治疗及高频电流。书中记载有一个实验，处于电场中的莱顿瓶（Leyden jar）（图1-26）中的红色小体（即血液中的红细胞），在发电的情况下，其形态发生改变并失去原有的红色，这大概就是描述了在电穿孔下发生溶血的情况。这里的莱顿瓶就相当于一个电容，用来收集并积累由静电发生仪所产生的静电，当积累达到一定程度时，产生高电压及高电流短脉冲，而高电压及高电流短脉冲恰恰是处在悬浮液中的红细胞发生电穿孔所需要的条件。

18—19世纪，已有很多研究报道注意到了我们今天认为是“电穿孔”的这一现象的存在。但机制尚不明确，其中没有提到这一现象造成的细胞膜破坏、膜通透性增加这一电穿孔的实质，用一句话总结就是“知其然，不知其所以然”。

二、初探机理

20世纪早期，有人将生物组织放置于电场中，观察其效应，事后被认为与电穿孔有关。Jex-Blake于1913年对工业电击和雷电致人类死亡的认识系列文献进行了综述，他认为在工业电击事故中，电热效应导致的烧伤是最常见到的致死原因，但雷电击伤则不同，电热效应不是主要的致死原因。当时，在雷电击伤方面，由IRE引起部分损伤的观点已经被接受。

1777年，德国物理学家利希滕贝格（Lichtenberg）用高压粒子加速器施加于玻璃而自创闪电奇观。这些奇观形成一幅幅美丽的图案，这些图案被称为利希滕贝格图样（Lichtenberg figures）（图1-27）。有一种现象就是当人遇到雷电击伤而没有死亡时，会在皮肤上留下富有特征性的利希滕贝格图案，在几天内消退（图1-28）。这种图案可能与前文提到的Nollet氏红点具有相同的发生机制，即它们都是由发生在皮肤部位的电解质击穿，局部电子物质聚集，导致毛细血管通透性增加，血液中红细胞移出血管进入皮肤浅层所形成的图案。

Jex-Blake还提到了一项有意思的试验，当对受电击而引起心力衰竭（简称“心衰”）的动物进行另外一次电击后，动物的心衰奇迹般康复了。第一次电击使动物发生了心室颤动，出现了心衰，第二次电击相当于除颤，所以动物出现了康复。当然，当时还没有“心室颤动”这一词。在这一过程中，电穿孔在除颤方面发挥了主要作用。

20世纪30年代，电场对生物体的热效应已经是大家所共识的。在1936年，McKinley将自己的研究结果结合20世纪20—30年代的研究结果进行总结分析，提出高频电场（10～100MHz）对活体组织造成的损伤不仅仅是大家所熟悉的热源性的，还有一种特殊的“因素”存在，尤其是与神经组织相关。他还提出这种特殊的“因素”和电场的存在密切相关，可以用来选择性消融某些特定的组织，可作为一种微创的消融治疗方法来使用。但在他本人的实验研究中采用了鸡的胚胎作为研究对象，在方法学方面尚缺乏足够的数据说明发生了电穿孔现象。虽然如此，他提出的电场对生物体细胞造成损伤的机制除了热源性以外，还存在其他机制这一结论，对后来进一步研究发现电穿孔实质具有重大意义。

在1951年，Hodgkin提出Ritter氏开放式破伤风现象是在异常增高的电位变化下，和膜的绝缘性破坏有密切关系。很显然，他对这一现象的解释和如今我们所说的IRE现象很相似。这里的“膜”就是今天我们所说，作为细胞外面的一薄层“绝缘膜”或“介质膜”的细胞膜。实际上将细胞膜设想为一层很薄的介质膜的构想已经存在很久了。早在1925年，Fricke在假设红细胞膜作为一种电绝缘膜的情况下，通过红细胞的一些被动性电特性，就已经假定了细胞膜的合理的厚度应该在30nm，而不是实际的7nm。一旦细胞膜被看作是一种薄的绝缘层，那么就有理由认定活体细胞的这种绝缘膜和所有的绝缘材料一样会发生崩解、破裂，从而导致其绝缘性破坏。最常见的崩解机制是雪崩式崩解，将一绝缘膜放置于足够强大的电场中时，被束缚的电子就会被激活，逃离束缚，加速运动，和其他电子发生碰撞，从而激活更多的电子，这一过程会导致绝缘膜的导电性大大增加，达到一定程度后，就会损坏绝缘膜的物质结构。当然，现在我们已经弄清楚了，电穿孔不是由于绝缘膜的雪崩式崩解所造成的。但是，跨细胞膜的过高电压能够造成细胞膜的崩解这一构想对后来设计电穿孔试验确实起到了非常大的启示作用。

20世纪早期的这些研究亮点，都说明了生物体置于电场中的一些效应，和后来的电穿孔有一定的联系及一致性。细胞膜可看作是一层绝缘膜，且能够在高压电场中发生崩解，这一概念已经深入人心。在这一时期，达成的最有意义的共识，就是电场不仅能够通过产热造成生物体的损伤，而且能够通过非产热的方式造成生物体损伤，而后者正是电穿孔被发现的基础。另外，还有一个共识就是电场能够造成细胞膜的不可逆性损害，这也为后来的电穿孔现象的发现奠定了基础。可以说，这一阶段，属于对电穿孔现象机制的初步探索，用一句话来总结就是“初探机理”。

三、电穿孔机制初步探明，不可逆性电穿孔技术开始应用

这一阶段在1951—1970年。由于Galvani之前已经做过电刺激神经的实验研究，因此，用神经组织作为研究对象，设计一个系统的可逆性电穿孔（reversible electroporation，RE）和IRE的实验研究，就不会引起太多的质疑。1956年，Frankenhaeuser和Widén报道了他们的关于探索阳极中断兴奋（anode break excitation）现象机制的研究结果，他们把这一现象描述为：当在1根神经的神经节上施加一幅值超过阈值10倍、脉宽小于1ms或超过100ms的电脉冲时，正常神经的传导性会发生改变。他们还指出这一现象不是什么新鲜事儿，实际上这一现象在1898年就已经有人报道过。他们认为，这种传导性的改变是由于过强的电脉冲会造成神经节被大范围地破坏、灭活，即发生IRE，没有灭活的部分，即发生了RE。

1951—1960年，Stǎmpfli和Huxley等合作进行了一系列的研究，都是有关青蛙神经膜的可逆性和不可逆性电穿孔研究的。他们宣称已经证实了Frankenhaeuser和Widén的研究结果，观察到在1根有髓神经上施加较强的正向脉冲，能够引出阳极中断兴奋现象。这种脉冲能够影响细胞膜的电阻及电位而使其崩解，如果增加膜电位从70mV到100mV，那么跨细胞膜的电压梯度相应的会增加至500kV；如果仅仅是一次短的脉冲，则细胞膜在崩解之后很快恢复；如果继续给予强大的10V的膜电位，细胞膜就会发生不可逆性破坏。进一步研究发现，对于单一的1根绝缘的含有郎飞结的蛙神经，5s的电脉冲就能够引起细胞膜电位达到120～140mV，相应的跨膜电压梯度达到了接近500kV，这时会导致细胞膜电阻抗消失，细胞膜发生崩解。在有些情况下，这种崩解多数是不可逆性的，但有时是可逆性的。这一现象类似于电容绝缘场的崩解。以上观察到的RE现象是在他的特定的装置里，且在发生细胞膜崩解时及时关闭电场的情况下发生的。

纵观IRE的发展历史，可以看出，在生物医学领域取得丰硕研究成果的同时，在食品加工技术领域也同样取得了巨大进步。在食品加工领域，IRE被称作脉冲电场（pulse electric feild）处理或电细胞质溶解（electroplasmolysis），相当于组织的细胞膜崩解，用于在液体中提取内容物，或用于液体中的细菌杀灭处理。电场的非热效应杀菌作用最早是由Fuller在1898年报道，这方面的研究一直延续至今。然而，这一时期内，从表面上看，所有的研究者对于电场具有杀菌作用的机制认识，并不在乎是热效应还是电化学效应或是别的什么机制。比方说，Sale和Hamilton在他们1967年的重要作品中，引用了Burton于1949年出版的一篇综述，该综述解释了支持和反对电场热效应的各种理由。Burton还在1950年Nature杂志上发表了一篇书信，在信中他对之前Nature上发表的一篇文章的观点提出了反对意见。该文章认为利用强大的射频电场在致死温度以下杀灭混悬液中的大部分细菌是有可能的。然而，在1961年，Doevenspeck报道了一种商业化的设备，该设备能够在肉制品的食品工业加工中将细胞成分解离出来。该设备就是通过电场的非热效应实现的，有点类似于今天所说的IRE现象。这些涉及处理的原料中炭精电极的电脉冲放电过程。值得强调的是，这篇文章没有特意提到细胞膜的电击穿现象，也没提到电脉冲应用方面的特定价值。然而，机制是很明确的，是属于细胞膜的非热消融。而且，Doevenspeck还发现电脉冲在利用非热效应杀灭微生物的同时，伴随着局部高达30℃的温度变化。

“电场具有杀菌作用”这一有趣的发现直接激励了Sale和Hamilton的研究团队，于是就产生了3篇相关的重要学术论文，在IRE领域打下了基础，为将来在电穿孔方面深入研究开辟了道路。第一篇文章展示了高场直流电脉冲能够杀灭细胞而无热效应产生。他们认为，采用10个直流电脉冲，脉宽短至2～20μs，脉冲间隔长达数秒，能够有效减少温度的上升。进一步系统的研究发现，对于多种细菌以及两种酵母菌，这种杀菌作用与细胞的周期、pH是否存在电解或加热无关。在杀菌过程中，测到的温度升高大约10℃。他们认为，和杀菌有关的参数按照重要性依次是电场强度、外加电场作用的时间。电场强度是完全杀灭细胞的最关键因素，如6kV/cm的场强能够杀灭酿酒酵母菌，而16kV/cm的场强能够杀灭大肠埃希菌。

在第二篇论文中，Sale和Hamilton重点阐明了电脉冲杀灭细胞的机制是半渗透屏障作用的细胞膜功能的不可逆丧失。在论文中，他们报道了大肠埃希菌细胞在电脉冲作用后，其细胞内容物在介质中发生了渗漏，并在光镜下观察到细胞膜完整性丧失的图像。他们还观察到红细胞及原生质体在电脉冲作用下，细胞膜功能不可逆丧失，导致了细胞的死亡。大肠埃希菌及红细胞的电镜观察发现，完全性的细胞膜击穿并没有见到。因此他们认为，直流电脉冲造成细胞的损伤发生在细胞的特定区域，这一区域尚不可知。

在第三篇文章中，Sale和Hamilton主要阐述了能够引起生物体溶解的电场强度是3.1～7kV/cm，脉宽20μs，10个脉冲的方案就能够达到50%的致死效果，相应的跨膜电压从0.7V到1.15V。他们认为，跨膜电压能够引起细胞膜构象发生改变，从而导致其半渗透性的丧失。

为了计算跨膜电压，他们采用了一个模型，将细胞看作是一个孤立的，与周围有导电性的介质，但有一层薄的绝缘层隔开的球体，这样就可以根据Maxwell的计算混悬液中球体导电性的方程式推导出一个方程式，跨膜电压（V_m）在面向电极（电场方向E）的一极存在最大值，在这两点的电压值V_m=（2/3）×a×|E|，其中 a为细胞的半径，在细胞的任何一点，跨膜电压 V_m =（2/3）×a×|E|×cos（θ），θ为细胞表面某一点到细胞中心连线与电场方向的夹角，这一方程式被称为Schwan氏方程。

总之，在20世纪60年代末，电脉冲能够改变细胞膜的通透性，非热效应导致细胞溶解已经成为共识。初步探明RE和IRE区别主要是电脉冲的强度不同造成的。IRE技术初步应用于食品加工的消毒领域。用一句话总结就是“电穿孔机制初步探明，IRE技术开始应用”。

四、可逆性电穿孔机制进一步明确并开始应用

1971—1990年这20年的时间内，RE领域取得了重要的进展，以至于RE技术成为生物科技及医学领域主要的应用技术，对其发生机制也进一步明确。1972年，Neumann和Rosenheck发现，场强为18～24kV/cm，脉宽150μs的电脉冲能够使牛骨髓嗜铬颗粒细胞的细胞膜发生可逆性通透性增加。实验在0℃进行，在这一过程中，温度最高上升到6℃，故导致细胞膜通透性增加的机制是非热效应。尽管他们的实验涉及RE现象，但限于当时认识的局限性，没能将膜通透性增加归结为外加电场引起的极端跨膜电压导致的现象，而是将这一现象与神经元生理性释放神经递质或激素相联系在一起。

Zimmerman及其研究团队通过观察发现电子的库尔特细胞计数器（图1-29，图1-30）上的读数不相一致，于是认定是计数器上的外加电场导致了细胞膜崩解。他们采用的方法是将计数器上和平行板之间进行的实验与液体的拉普拉斯方程相结合，这样获得了关于细胞电穿孔方面所需要的相关电参数，首次产生了系统性的相关数据。通过对牛和人的红细胞研究，他们探索到导致细胞膜崩解、细胞内容物游出而在细胞外液中出现，所需要增加脉冲的脉宽及幅值之间的关系。他们观察到细胞内容物在细胞外液中出现并逐渐达到最大量时，所需要的脉宽是50～100μs，所需电场强度为2.6～2.8kV/cm，导致细胞膜崩解的临界膜电位需要1V。他们的研究团队在1974年发表了一系列的相关论文。值得一提的是，他们的研究数据和IRE参数极度相关。这些参数作为渐近值列于其研究论文中，很有意思的是，他们还发现了人和牛红细胞具有不同的渐近值，这一点提示在组织电穿孔时需要用不同的方法。他们还发现这种效果不是热源性的。他们团队具有应用价值的研究成果是推荐了红细胞和淋巴细胞可作为药物和酶的载体系统。

在1977年，Kinosita和Tsong提出在施加电脉冲后细胞膜的通透性与细胞膜上形成的小孔有关，该小孔半径只有几埃（Å）（1Å=10-10m）。在经典的红细胞渗透性实验中，他们观察到这种小孔的大小各不相同，且最终发生了闭合。同时，他们还提出，这种透性化的细胞可作为化学标本的载体通过血循环。在评估穿孔的细胞需要多长时间才能闭合时，他们发现温度是其中一个影响因素，在37℃时，穿孔的细胞膜很快恢复对阳离子的不通透性，而在3℃时，细胞保持很长时间的通透性，甚至达到20h以上。这一发现提示：即使在使用RE参数的情况下，降低温度能够产生类似于IRE效果。

1978年，Belov发表了一篇文章，虽然没有被人引用过，但该研究和IRE现象的发现背景密切相关。该研究也许是首次在活体内有意进行的探索性研究报道。在一项有关电外科设备产生凝固性坏死类型的研究报告中，Belov提出外科的凝固性坏死和细胞膜的崩解有关，而细胞崩解由电脉冲引起，这种脉冲具有高峰值平均电压比。而高峰值平均电压比早在1938年Tatrinov就研究报道过。Belov的实验采用蛙腿肌肉组织作为研究对象，采用500个脉冲，电场强度为8.5kV/cm，脉宽1μs，1 000个脉冲，电场强度为7.5kV/cm，脉宽2μs两种条件，都能引起细胞膜的损坏，在此过程中没有热效应产生。

在1982年，出现了两大发现，这两大发现将RE技术推向了生物科技及医学的前沿，它们是应用了RE技术的细胞融合技术（图1-31，图1-32）及细胞内基因导入技术。Zimmermann报道了RE技术可使细胞发生相互融合。后来Ramos和Teissie两人对细胞融合技术进行了系统性的综述。Neumann及其同事在1982年在一篇综述中首次创造性使用了“电穿孔（electroporation）”这一词来描述细胞膜的损坏，并提出了RE技术可用于细胞内基因导入。同时，他们还展示了在电穿孔期间细胞膜微孔形成的经典的热动力学分析。值得感兴趣的地方是这篇论文中，在关注安全的RE的同时，要更加注意其可能会发生IRE的相关参数的警告参数内容，而这些被警告的参数恰恰是我们追求IRE所需要的。之所以要提起这件事，是因为在之后20年的IRE研究中，都采用了RE所使用的参数的上限。因为在当时，人们对RE方面关注较多，相关应用研究的成果也相当显著，在IRE方面研究应用较少，往往在研究RE时，要重点避免参数设置过高，出现IRE。

直到20世纪80年代，针对电穿孔的研究还主要集中在细胞电穿孔上面。1987—1989年，开始针对组织电穿孔进行研究，到80年代末，人们才开始大量研究IRE。

Okino、Mohri及Orlowski等人分别提议，RE可造成细胞膜的通透性可逆性增加，利用这一点可以向恶性肿瘤细胞内导入细胞毒性物质，用来治疗肿瘤。很快RE技术被应用于治疗肿瘤，这就是后来所说的电化学疗法（electrochemotherapy）（图1-33）。

1989年，Powell等人进行了青蛙皮肤导电系数的测量研究，发现青蛙皮肤能够发生RE。他们没有进一步报道这种RE对经皮肤的药物导入产生何种影响，但受此现象启发，后来者Prausnitz等人据此应用了RE技术使得经皮传送药物的效果大大增强。

1987—1988年，Lee及其同事们进行了放电导致组织损伤的研究，是组织IRE领域重要的系列研究，他认为放电引起的焦耳热乍一看似乎是造成组织损伤的原因，尤其是与皮肤的接触点，但却不能解释远离接触点部位的组织发生损伤。他们用大鼠的肌肉细胞作为研究对象，将其暴露在20～300V/cm的电场中，持续1ms，间隔30s，每次场强增量25V/cm。在整个实验过程中，对系统温度进行了监测。解剖分离好的大鼠肌肉组织，给予30次电脉冲，持续1s，场强150V/cm，间隔5s，在每个脉冲序列开始和结束后测量肌肉的电阻。结果显示：随着脉冲强度从50V/cm增加到300V/cm、脉冲次数从1次增加到30次，肌肉细胞发生了不可逆性损伤。而在此过程中，组织温度升高的确没有超过0.1℃。结果显示，组织在施加了电脉冲后，阻抗降低，这一点可作为组织损伤的一个指标。在这一过程中，温度的增加仅仅为0.7℃，再次证实了这种损伤是非热源性的。这一实验同时表明，100V/cm的场强，持续1s，可以达到10～20℃的温度增加。他们认为，在这种情况下，细胞相对于这种热源性损伤还是非热源性损伤机制来说，都是非常脆弱的。在这种情况下，搞清楚究竟是什么原因导致的细胞破裂非常必要，因为不管是电穿孔还是电热作用，都可以造成细胞破裂及细胞毒性作用。

总之，这20年结束的标志是RE及细胞融合技术成为生物科技和医学研究的工具。有一本书由Neumann等1989年编写出版的，书名叫《电穿孔技术和电融合技术在细胞生物学中的应用》很好地反映了这一时期的研究特征。这一阶段，RE现象的机制已经十分明确，人们开始将这一现象广泛应用在生物医学领域，如细胞融合、电化疗、基因导入等，用一句话总结就是“可逆机制进一步明确并开始应用”。

五、可逆性电穿孔技术广泛应用，不可逆性电穿孔技术应用开拓新领域

在20世纪90年代，许多关于RE的构想，因前期产生于70年代或80年代，已经足够成熟，可以应用于商业经营及临床。

自从Potter设计出适合电穿孔细胞悬液的小试管后，微生物研究中开始应用电穿孔技术于电泳电源，来实现基因的转染（图1-34）。之后不久，多款有关利用电穿孔技术的基因的转染仪器面市，如今，基因转染在微生物学实验室已经变得非常普及了。有关该技术的总结及应用方面的书籍也有较多出版，如前文提到的《电穿孔技术和电融合技术在细胞生物学中的应用》、Nickoloff于1995年编写出版的《电穿孔工具在微生物学中的应用》等。

在1991年，Titomirov等人首次发表了RE技术应用于活体组织DNA质粒导入的文章，在活体组织内，基因的细胞内转移在生物技术及医学中占有重要地位，而该项技术的核心内容是RE技术。也有人将该项技术应用于治疗肿瘤。

在1991年，Mir等人发表了两篇有关RE技术治疗癌症具有突破性的文章。该技术能够使抗肿瘤药物，如博来霉素等，更容易进入肿瘤细胞内，从而增加其抗肿瘤效果。他们还创造出了一个词“电化疗”，用来描述这种治疗方法，同时还首次报道了电穿孔领域的相关临床试验结果。如今，电化疗已经成为一项成熟的RE应用技术，被广泛应用于临床治疗肿瘤中。

在这10年内，有关皮肤组织的药物传送方面的电穿孔应用也是电穿孔技术应用的一个重要方面。电穿孔技术经皮药物传送的研究在1993年就已有报道。随后又有多篇文章对该技术做了综述。

IRE在组织电击伤后可能造成组织损伤的机制研究，始于20世纪80年代，一直没有停止，Lee起到引领作用，开展的研究对IRE在组织损伤方面的机制研究贡献较大。在这个研究领域有人发现，细胞膜的IRE可以被表面活性物质治疗而愈合，是一个新的、有趣的发现。

通过以上多位研究者的结果，可以很容易得出一个结论，那就是电穿孔导致的细胞膜过度通透导致细胞渗透压平衡破坏，是电穿孔导致细胞死亡的机制。然而，在20世纪90年代，有两篇独立的报道认为：电穿孔不仅能够引起组织细胞坏死，还能够引起细胞的凋亡。在这两篇文章中，都报道了电穿孔可引起细胞内染色体DNA断裂，而这一现象是细胞发生凋亡的确定性征象。另一个有趣的文章由Piňero报道，他认为电穿孔作为电疗的一种方法，能够杀死肿瘤细胞，是一种很有前途的肿瘤治疗方法，可避免常规化疗药物的毒性作用。他还提到了电化疗治疗实体肿瘤，可以看作是最早提出IRE技术作为肿瘤消融方法之一的报道。

1997年，Schoenbach等人报道了首次进行持续时间亚微秒级、极高电压脉冲的体外实验应用。之后，出现了大量的持续时间纳秒级或数十纳秒级的短脉冲研究论文。以纳秒级脉冲电场（nanosecond pulsed electric field，nsPEF）而著称的超短脉冲，能够引起细胞内膜穿孔（如线粒体膜）而细胞外膜则不受影响，这也是纳秒级脉冲研究的主要动机。在传统的电穿孔实验中，所用的脉冲大于10μs，细胞膜在几微秒之内被充电到稳定的跨膜电压，细胞内结构则不受外加电场影响，故而不会出现细胞内膜的电穿孔现象。相反，由于存在这样一个规律：充电时间始终和被作用对象的结构大小成比例，即充电时间越短，越容易造成较小直径的结构膜发生破坏；相反，充电时间越长，越容易造成较大直径的结构膜发生破坏。因此，一个极短且极强大的电脉冲被应用时，那些较小的细胞内结构，如细胞器、细胞核等容易被充电至极高电压而出现膜结构的击穿，而直径较大细胞的外膜则不会出现充电至极高电压而出现膜结构的击穿现象。最近的电脑模型及实验研究结果显示：当纳秒级脉冲被应用时，也可以发生细胞外膜的电穿孔。也就是应用nsPEF，则所有的细胞膜结构均发生穿孔，有些作者称这种现象为超电穿孔（supraelectroporation）。值得指出的是，研究者在这种高电场下，采用nsPEF能够诱导细胞凋亡，甚至纳秒级脉冲的体内应用表明，其具有抑制肿瘤生长的作用。这些研究，在IRE机制方面更深入了一步，为后来肿瘤消融方面的应用打下了基础。

1998年，在RE研究过程中，发现一个重要的现象，即在施加电场的区域，血流被阻断。有人将这种现象称为“血管锁（vascular lock）”，在肌肉、肝脏及肾脏电穿孔应用的过程中均被发现。而血液灌注的中断会造成药物动力学方面的异常及继发组织缺血，这一点可能有利于肿瘤的治疗。事实上，在肿瘤治疗方面，有人还利用电穿孔技术来有意识地追求肿瘤血液供应的中断。Gehl认为“血管锁”现象可能存在两种机制：其一，电刺激、细胞膜的过度渗透性可能反射性地引起交感系统活性增加，输入端小动脉收缩；其二，血管内皮细胞的过度渗透性引起间质压力增加和血管内压力增加，由此引起血管塌陷。

总之，在20世纪最后10年里，有很多刚性证据表明RE技术已经成为一项常规的微生物实验技术，而且首次应用在动物体内并常规开展相关临床试验。IRE机制研究继续深入，开始涉足肿瘤消融领域，用一句话进行总结就是“RE技术广泛应用，IRE技术应用开拓新领域”。

六、纳米刀问世前的相关研究

1997年，Schoenbach等人首次报道了进行持续时间亚微秒级、极高电压脉冲的体外实验应用。之后，出现了大量的持续时间纳秒级或数十纳秒级的短脉冲研究论文。超短脉冲能够引起细胞内膜穿孔而细胞外膜则不受影响，这也是纳秒级脉冲研究的主要动机。结果显示：当纳秒级脉冲被应用时，也可以发生细胞外膜的电穿孔。也就是应用nsPEF，则所有的细胞膜结构均发生穿孔，也被称为超电穿孔。在这种高电场下，采用nsPEF能够诱导细胞凋亡，抑制肿瘤生长。

在2004年，Yao等人受到nsPEF研究系列结果的启发，应用了一种特殊脉冲，即陡脉冲电场（steep pulsed electric field，SPEF）来杀灭细胞，达到体内抑制肿瘤的目的。这种SPEF脉冲通过一个电容放电来实现，由一个快速上升的前沿（上升时间200ns）和随后一个缓慢的呈指数的下降的后沿（约200μs）组成。它结合了高频脉冲的上升坡度所造成的细胞内膜结构的破坏及低频脉冲的下降坡度所造成的细胞外膜结构的破坏特点，从而达到了同时破坏细胞核、细胞器及细胞膜的作用。确实，他们成功地达到了杀灭细胞、抑制肿瘤生长的目的。考虑到低振幅脉冲应用及200ns的上升时间，造成非常标准化的电穿孔，他们所使用的方法及其所得到的结果应该和今天经典的IRE技术没什么区别。尽管他们可能是无意识的发现，但极有可能他们的研究是首次获得了IRE肿瘤消融方面的经验性依据的研究。

同样，在2004年，Davalos和Rubinsky（图1-35）就2003年所使用的传统的IRE（脉宽大于5μs）用于组织消融的方法申请了美国发明专利。专利公布后，发明者对操作过程中所使用的电压值及电极布阵方案进行了公布。他们同时指出，IRE可用于灌注区域如邻近大血管的组织，而这一点和热消融方法不同。接下来的系列研究发现，IRE作为一种组织消融方法，并不伴随着热效应，这一点在治疗后的邻近正常组织的修复方面具有重要意义。

Rubinsky团队接下来的研究目标主要瞄准肝细胞癌的IRE消融治疗。他们发现，IRE消融后，肝组织呈现选择性消融区域，边界不规则呈鼠咬状。IRE消融后3h组织学显示一些很有意思的特征：治疗区显示微血管堵塞、血管内皮细胞坏死及血细胞渗出、肝实质呈现缺血性损坏，肝血窦中有大量的红细胞聚集；肝细胞界限模糊，胞质呈嗜酸性染色，出现各种核固缩及空泡变性。而另一方面，肝内大血管结构保持完整。

这一段时间，一系列关于IRE消融动物实验的研究报告，是在严格模仿临床消融的条件下进行的。暴露动物肝脏后，在超声引导下将18G不锈钢穿刺针刺入肝内预定位置，消融的大小和形态，事先参考Edd和Davalos的方案制订出计划。完成消融后，动物分别在术后24h、3d、7d及14d处死，取出肝脏标本进行组织学分析。这个实验有几个有意思的结果及结论：①所有动物在消融后存活；②在施加IRE电脉冲时，每只动物都不同程度地出现肌肉收缩，这种肌肉收缩的程度似乎与术中给予的肌肉松弛药（双哌雄双酯）剂量有关；③施加电脉冲后即刻，超声显示为消融区域明显的低回声表现，而24h后超声表现为均匀一致的高回声；④组织学显示消融区域出现连续性的坏死，消融区域与正常肝组织的过渡很突然，过渡区域几乎没有；⑤肉眼大体观察显示大血管结构基本不受影响；⑥所有动物都出现了消融区域淋巴结增大。

同期，Maor等人将IRE消融应用于大鼠的颈动脉，条件：10次脉宽100μs的电脉冲，3 800V/cm。他们的小型试验结果显示：术后28d所有试验动物存活；血管的结缔组织基质保持完整，血管的平滑肌细胞数量明显减少，但没有出现相关病理改变如动脉瘤形成、血栓形成或管壁坏死。该结果提示IRE可安全用于邻近大血管的病灶消融治疗，而且平滑肌细胞数量明显减少，可用于血管平滑肌异常增殖的一些病变，如血管再狭窄及动脉粥样硬化。事实上，Maor团队已经开始研究IRE在血管再狭窄方面的应用了。

2007年，Onik等人将IRE消融应用于犬的前列腺，采用超声引导经皮穿刺途径将电极刺入犬的前列腺组织进行消融，之后的大体组织学观察发现：消融区域的坏死区与周围正常组织存在非常薄的过渡带，尽管邻近结构如尿道、血管、神经和直肠等这些组织结构同样位于高电场中，却不受IRE影响。2008年Rubinsky将IRE消融用于体外前列腺癌的消融，发现IRE消融对前列腺癌组织具有很彻底的杀灭作用。

Lee等人采用和Rubinsky团队类似的研究，对猪的肝脏组织进行了IRE研究，只不过没有采用切开暴露的方式，而是采用经皮穿刺的方式。组织学分析采用了凋亡标记分析。结果显示也和Rubinsky团队的结果类似，消融区域超声显示消融区域与正常组织过渡很突然；镜下观察，von Kossa染色、Bax染色及苏木精-伊红染色均显示消融区彻底的凋亡细胞。据此得出结论：IRE是一种全新的、独特的消融方法，可实时监测，操作时间极短，是非热源性消融方式，主要通过引起细胞凋亡而达到消融目的，易于控制消融范围。

Al-Sakere等人对皮下接种肿瘤的小鼠进行IRE消融研究，主要观察IRE后小鼠的免疫反应情况，弄清免疫系统在IRE肿瘤消融中发挥何种作用。他们的结论是免疫系统反应在IRE肿瘤消融中不是必需的。因此，IRE消融可用于治疗免疫抑制的肿瘤患者。他们选用80次0.3Hz电脉冲，脉宽100μs，脉冲间隔0.3s，场强2 500V/cm。使用这套方案，13例接种肿瘤的小鼠中有12例达到了良好的肿瘤抑制效果，且没有热效应产生。

Edd和Davalos通过计算机数学模型方式来模拟预测IRE消融的形态及范围，这种模拟的基本原则是：如果电场强度高于某一特定的阈值，就会产生任何特定组织的电穿孔。这个阈值根据不同组织类型及IRE脉冲的特征（脉冲的数量和持续时间）的不同而不同。一旦这个阈值通过试验获得，在计算机上通过几种方法，就可以根据电极在拟消融区域的排列方案及施加于其上的电压值来计算并预测电场分布情况。这种治疗方案制定的研究方法，在1998年，Miklavcic团队在IRE体内的实验研究中曾经使用过。

也是在2007年，Lavee等人发表了其5头猪的IRE心房消融的研究结果，目的是研究IRE治疗房颤的效能，确定和传统的热消融相比是否可以作为一种可供选择的治疗方法。他们观察到IRE消融后，消融区域和正常组织区域的分界十分清楚，过渡非常突然。组织学分析显示：心房细胞出现了明显的破坏，平均深度达0.9cm，消融灶表现出了电绝缘特性。得出结论：IRE是一种新的、令人激动的心房消融方法，它具有快速、准确、完全透壁且没有热效应的优点。

总之，2001—2007年这7年的时间内，在IRE方面的研究更加深入，对于IRE技术可以导致细胞膜通透性不可逆改变，继而引起细胞死亡的机制已无异议。通过大量的临床应用前的动物实验证实，IRE不损伤富含结缔组织骨架的结构，如血管、胆管、输尿管、神经等，或损伤后容易修复。这些方面的认识已经达成共识，这一点，恰好填补了传统消融禁忌领域的空白，具有极大的临床应用价值，为下一步IRE消融肿瘤设备（纳米刀）的问世及批准应用于临床打下了坚实的基础。用一句话进行总结就是“纳米刀问世前的相关研究”。