第一节　遗传性皮肤病的分子诊断

利用分子生物学技术检测遗传疾病，又称遗传疾病的基因诊断，是在分子水平上对核苷酸序列的遗传变异进行检测，用以在遗传物质的分子水平揭示疾病的发病机制和发病根源。分子生物学技术在人类遗传性皮肤病诊断中的应用是近几年分子生物学理论和技术手段不断发展，并在皮肤病临床诊断中逐步运用和普及的结果。本节我们就该领域的发展状况和所应用的新的生物学方法进行简要的介绍。

一、遗传性皮肤病的发病机制

随着遗传学的发展，人们发现自身遗传物质的向下传递并不是一成不变的。而群体遗传学认为正是由于这种DNA的变异，使同一物种个体间存在表型的多样性。随着物种的繁衍，那些有利于个体适应环境和生存的基因型会保存下来，逐渐得到巩固，并最终在繁衍中占有优势。而那些不利于个体生存和发展的突变型，则由于受人类自然婚配的影响，经过一个漫长的过程而逐渐消失。

遗传性皮肤病从分子水平上解释，究其根源正是由于皮肤病患者的遗传物质发生了DNA序列或者染色体片段的改变，而这种改变可能来自其亲代的基因变异，也可能由其自身的基因发生遗传变异而产生。目前所发现的常见遗传变异，可归纳为以下几种：①染色体某个区域的缺失，如类固醇硫酸酯酶（STS）基因的缺失所引起的X-连锁鱼鳞病；②某个基因部分外显子或者内含子的缺失，如NSDHL基因6～8号外显子的缺失引起的CHILD综合征；③基因的单碱基突变，如KRT1和KRT10基因突变引起的环状表皮松解性鱼鳞病。④小的插入缺失突变往往会引起对应的基因发生框移突变，因此与单碱基突变相比更容易影响所编码蛋白质的功能。一般来讲，遗传性皮肤病的发生比较复杂，往往包括上述两种或者两种以上的情况。

二、分子生物学技术在遗传性皮肤病诊断中的优势

运用分子生物学方法诊断遗传性皮肤病是近些年发展起来的新技术。传统遗传病的诊断方法多以疾病的表型病变和生物化学检查为依据，易受外界环境的影响。而以分子生物学为基础的分子诊断方法则是在DNA水平上对遗传疾病进行检测，揭示了发病的遗传本质，不但可以鉴定具有阳性表征的纯合个体，也可以鉴定出没有疾病表型的杂合携带者，从而有利于遗传疾病的早期筛查和遗传咨询。因此，分子诊断方法具有更准确、可靠和诊断时间更早等优点。

遗传性皮肤病的诊断往往非常复杂。目前只有极少数疾病的发病机制和有害基因比较明确，突变位点比较单一，可以通过分子生物学技术进行简单的直接检测。而绝大多数遗传性皮肤病均表现为表型多样、致病基因复杂和突变位点众多等特点，因此传统的遗传病诊断方法并不能真正确定病人所患皮肤病的种类和致病基因。针对此类疾病，以往实验室往往采用间接方法，即通过对与之有连锁关系的遗传标记的多态性进行检测来达到致病基因定位的目的。目前应用较多的包括限制酶酶切片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）和微卫星DNA序列（microsatellite DNA）。这种方法耗时较长，准确性较低，大大限制了生物检测技术在临床诊断中的应用。而近几年。随着科技的发展，很多高通量的生物学分析技术如生物芯片、第二代高通量测序（Next-generation sequencing，NGS）被广泛应用多种疾病的机制研究和临床诊断。它们的出现不仅扩大了基因的搜索范围，而且大大简化了临床操作步骤，是生物学史上一场划时代的革命，使临床的生物学诊断成为可能。

三、各分子生物学技术在皮肤病基因诊断中的应用

（一）以PCR为基础的基因诊断技术

1985年Mullis等发明了聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR），实验室研究人员可以在短时间内对目标DNA序列分子进行大量的扩增，从而突破了DNA研究的瓶颈，在基因研究领域引起了一场新的革命。截至目前，以PCR技术为基础，衍生出了许多灵敏而便捷的基因诊断方法。下面对它们进行简要的介绍。

等位基因特异性PCR（allele specific PCR，AS-PCR）是一种利用引物和模板如果在引物3’末端出现错配可以有效抑制PCR反应的原理，进而达到区分位点基因型目的的方法。临床上常在引物3’最末端加入一个含有突变碱基的序列，通过PCR扩增，如果得到扩增，表明该被测基因含有该种突变。该方法最大的难点在于如何提高AS-PCR对末端碱基错配的分辨力。目前最新的方法包括应用腺苷三磷酸双磷酸酶介导或者应用锁核酸技术（locked nucleic acid，LNA）。后者是由Latorra等人于2003年开发，将经过修饰的RNA分子与DNA分子相结合，从而提高两者结合的特异性。2009年Dian等人通过AS-PCR技术，发现TGM1基因为一例火棉胶样皮肤病胎儿的致病基因，该患儿由于分别携带了来自父亲的一个缺失突变和一个来自母亲的错义突变（Arg155Trp）从而导致发病。

实时荧光定量PCR技术（quantitative Real-time PCR，Q-PCR）是一种在DNA扩增反应中，通过检测荧光化学物质含量来测量每次聚合酶链式反应循环后产物总量的方法。目前应用较广泛的有两种检测方法，一种为SYBR Green法，即在PCR反应体系中加入过量的SYBR荧光染料，随着扩增产物的增多，其染料特异性地掺入DNA双链并发射荧光信号，使荧光信号的强度与PCR产物的增加成正比。另一种为TaqMan探针法，则利用Taq酶的5′-3′外切酶活性将扩增中的DNA探针酶切降解，从而使荧光发射基团和淬灭基团分离，释放荧光信号，使荧光信号的积累与PCR产物的形成完全同步。在遗传病的诊断中，Q-PCR不仅可以检测某固定位点的基因型，还可以对模板DNA进行定量分析，从而广泛应用于遗传相关的DNA拷贝数检测。最近，Bai等人应用Q-PCR和基因芯片相结合，发现一位X连锁的鱼鳞病和先天性葡萄糖醛酸转移酶缺乏症患者在2q37.1和Xp22.3两个区域同时存在拷贝数变异。

（二）基因芯片技术在遗传性皮肤病中的应用

随着研究的深入，研究者们发现很多遗传性皮肤病并不能直接确定发生变异的基因和所发生变异的种类以及位置，因此这就需要一种通量更高的分子生物学方法对病人在全基因组范围内的进行筛查。20世纪80年代，随着基因芯片技术的普及，人们开始借助这种高通量技术来进行染色体定位，再通过位点间的连锁关系寻找可能的致病区域和致病位点，从而大大提高了遗传病的诊断效率。

基因芯片技术，又名DNA微阵列，是将已知序列的数万个核酸探针固定在一块数平方厘米大小的基片表面，将其与荧光标记的靶核酸进行杂交，通过检测荧光的强度来确定靶核酸序列的数量或基因型。由于其通过一次检测，就可以同时获得大量基因的序列或者表达特征，因此已成为基因组学和遗传学研究的重要工具。目前根据其检测目的不同，可分为DNA微阵列（检测样本基因组DNA）、cDNA微阵列（检测样本mRNA表达程度）、miRNA微阵列（检测样本miRNA表达）、染色质免疫共沉淀-芯片（检测蛋白与DNA的结合程度）、CGH芯片（检测样本DNA的拷贝数变异）和SNP芯片（检测样本基因型）。其中，在遗传病研究领域，CGH芯片和SNP芯片应用更为广泛。

比较基因组杂交芯片（comparative genomic hybridization array，array-CGH）技术是使待测组织和正常组织的全基因组DNA分别标记不同荧光，再竞争性地与微阵列上的靶序列杂交，根据两者的荧光强度差异判断被测样本DNA的拷贝数变异。与传统的比较基因组杂交以及染色体荧光原位杂交相比较，该方法具有精度高、准确性强、高度自动化等特点，一经推出就广泛应用于遗传病研究领域。2011年，Faquer等人借助array-CGH技术对一例带有脂肪代谢障碍、癫痫、鱼鳞病等多种临床特征的患者进行检测，发现在染色体5q31.3-5q33.1有一个长度约为10M的基因组重复区域。另外，Wang等利用array-CGH和荧光定量PCR也证实一位患儿在2q31.1存在一个大小约为3.6Mb的微缺失，从而影响ITGA6基因功能，导致患儿发生大疱性表皮松解症。

（三）外显子测序技术在遗传性皮肤病中的应用

人类基因外显子约占总基因组大小的1%，但却包含了合成蛋白质所需要的全部序列，是DNA重要的功能区，人类疾病约85%的基因突变位于该区域。因此对人类外显子的序列检测将有助于我们揭示多种遗传性疾病的病因。然而由于传统的一代测序存在成本高、速度慢、通量低、操作复杂等技术瓶颈，难以满足大规模基因组测序的需要。2005年，以美国454 Life Science公司、Illumina公司和Applied Biosystem公司为代表，先后开发了新一代大规模平行DNA测序技术（massively parallel DNA sequencing technology）（图5-1）。它一次可以对上百万条DNA分子进行序列测定，克服了传统测序的技术难题，推动基因组学乃至整个生命科学研究进入一个史无前例的发展阶段，因此有文献称其为新一代测序（nextgeneration sequencing，NGS）技术。

外显子组测序技术则是在NGS基础上进一步利用探针杂交法捕获全部外显子，整个过程主要包括外显子序列的捕获和富集、构建测序文库并测序以及生物信息学分析3个主要步骤。与转录组和全基因组测序技术相比较，外显子组测序在获取编码基因信息方面具有高效、准确、低成本的特点；同时该方法与全基因组关联分析技术（genome-wide association analysis，GWAS）相比，能更有效地检测基因组中的稀有变异，因此更容易发现遗传疾病的致病基因。在捕获技术发展初期，捕获探针主要以固相捕获探针为主，探针被固定在固相载体上进行片段的捕获。该方法由于受到接触面积的影响，因此大大限制了目标DNA与探针的结合。而近几年，Agilent和NimbleGen公司均开发了液相捕获探针，该方法允许目标DNA与核酸探针在一定体积的液体内进行杂交，从而大大提高了结合效率，降低了模板DNA使用量，因此已在临床检测和科学研究中被广泛使用。

目前国内外已经有多篇关于利用外显子组测序成功发现遗传性皮肤病致病基因的报道。家族性剥脱皮肤综合征是一种常染色体隐性遗传病，患者多表现为浅表皮肤广泛无痛性脱皮。2012年，Cabral等利用外显子组测序技术在一个家系中首次发现CHST8基因突变与剥脱皮肤综合征的发病有关。进一步功能试验也证实该突变可以明显降低高尔基体对硫酸化糖胺聚糖的转运。在我国，遗传学家也利用外显子组测序技术在皮肤病领域取得了一些成果。反常性痤疮也称化脓性汗腺炎，好发于青壮年，是一种在腋窝、腹股沟、肛周等部位反复出现囊肿、脓肿、结节的慢性炎症性皮肤病。约40%的患者有遗传性。Wang等通过对3个汉族反常性痤疮家系进行外显子组测序发现编码γ-分泌酶的辅助因子NCSTN发生突变。2012年，Lin等利用外显子组测序在国际上首先发现TRPV3基因是Olmsted综合征的致病基因，其后他还通过电生理等试验证实该变异为功能增强性突变，致使角质形成细胞凋亡增加。

四、各分子生物学技术在皮肤病基因诊断领域的优缺点比较以及应用展望

综上所述，目前已开展多种分子生物学技术用于遗传性皮肤病的基因诊断，每种方法均各有自己的优势。PCR技术主要适用于已知的或者比较确定的遗传变化，其操作简便、周期较短、成本较低，主要用于验证已发现的遗传变异以及精确定量。生物芯片技术则是在全基因组范围内对可能的遗传变异进行定位，其与全外显子组测序相比不仅可以定位遗传变异的位置还可以查看染色体的结构变化。而与前两种方法相比较，全外显子组测序则更容易检测到基因组中的稀有变异，因此定位更加准确。但其实验周期较长，成本较高，且由于该技术为新生技术，目前还未通过我国的诊断资质评审，因此大大限制了该技术的推广。但未来，该技术必将替代现有的诊断方法，成为医疗诊断领域的主流。

在实际遗传性皮肤病的诊断中，往往需要多种方法相结合。例如，当研究者遇到一例疑似遗传病的家系，往往需要先根据患者的临床特征，判断可能的遗传疾病，再利用简单的PCR技术对已知的引起该疾病的常见基因变异进行初筛；如未发现任何已知的遗传改变，则需要采用基因芯片和全外显子组测序对整个家系成员进行扫描，找出可能的致病基因；最后再利用PCR方法，对该致病位点进行验证，从而确立该家系的致病基因。除此之外，最近一种定制化的捕获芯片技术慢慢兴起，研究者可以有目的地针对某些特定疾病捕获和检测感兴趣的基因，该技术的出现大大简化了研究者的劳动，同时降低了实验的成本，必将成为遗传性皮肤病领域的又一新兴技术。